Alzheimeri tõvel (AD) puuduvad valgu biomarkerid, mis peegeldavad selle mitut aluseks olevat patofüsioloogiat, takistades diagnoosimise ja ravi edenemist. Siin kasutame laiaulatuslikku proteoomikat, et tuvastada tserebrospinaalvedeliku (CSF) biomarkereid, mis esindavad laia valikut AD patofüsioloogiat. Multipleks-massispektromeetria tuvastas AD CSF-is ja ajus vastavalt ligikaudu 3500 ja ligikaudu 12 000 valku. Aju proteoomi võrguanalüüs lahendas 44 bioloogilise mitmekesisuse moodulit, millest 15 kattusid tserebrospinaalvedeliku proteoomiga. Nendes kattuvates moodulites olevad CSF AD markerid volditakse viieks valgurühmaks, mis esindavad erinevaid patofüsioloogilisi protsesse. Sünapsid ja metaboliidid AD ajus vähenevad, kuid CSF suureneb, samal ajal kui gliiarikas müelinisatsioon ja immuunrühmad ajus ja CSF-is suurenevad. Paneelide muutuste järjepidevust ja haigusspetsiifilisust kinnitati enam kui 500 täiendavas CSF-proovis. Need rühmad tuvastasid ka asümptomaatilise AD bioloogilised alarühmad. Üldiselt on need tulemused paljulubav samm veebipõhiste biomarkeri tööriistade suunas AD kliinilisteks rakendusteks.
Alzheimeri tõbi (AD) on maailmas kõige levinum neurodegeneratiivse dementsuse põhjus ja seda iseloomustavad mitmesugused bioloogilise süsteemi düsfunktsioonid, sealhulgas sünaptiline ülekanne, gliia vahendatud immuunsus ja mitokondriaalne metabolism (1–3). Kuid selle väljakujunenud valgu biomarkerid keskenduvad endiselt amüloidi ja tau valgu tuvastamisele ega suuda seetõttu kajastada seda mitmekesist patofüsioloogiat. Need "tuuma" valgu biomarkerid, mida mõõdetakse kõige usaldusväärsemalt tserebrospinaalvedelikus (CSF), hõlmavad (i) amüloid-beeta peptiid 1-42 (Aβ1-42), mis peegeldab kortikaalsete amüloidnaastude moodustumist; (ii) totaalne tau, aksoni degeneratsiooni märk; (iii) fosfo-tau (p-tau), patoloogilise tau hüperfosforüülimise esindaja (4-7). Kuigi need tserebrospinaalvedeliku biomarkerid on oluliselt hõlbustanud meie "märgistatud" AD valguhaiguste tuvastamist (4–7), moodustavad need vaid väikese osa haiguse taga olevast keerulisest bioloogiast.
AD biomarkerite patofüsioloogilise mitmekesisuse puudumine on toonud kaasa palju väljakutseid, sealhulgas (i) võimetus tuvastada ja kvantifitseerida AD patsientide bioloogilist heterogeensust, (ii) haiguse raskuse ja progresseerumise ebapiisav mõõtmine, eriti prekliinilises staadiumis, ja (ii) iii) terapeutiliste ravimite väljatöötamine, mis ei suutnud täielikult lahendada kõiki neuroloogilise seisundi halvenemise aspekte. Meie sõltuvus olulisest patoloogiast seotud haiguste AD kirjeldamisel ainult süvendab neid probleeme. Üha enam tõendeid näitavad, et enamikul dementsusega eakatel inimestel on rohkem kui üks kognitiivse languse patoloogiline tunnus (8). Tervelt 90% või enamal AD patoloogiaga isikutest on ka veresoonkonnahaigused, TDP-43 kandmised või muud degeneratiivsed haigused (9). Patoloogilise kattuvuse suur osakaal on häirinud meie praegust dementsuse diagnostilist raamistikku ja vaja on haiguse põhjalikumat patofüsioloogilist määratlust.
Pidades silmas tungivat vajadust mitmesuguste AD biomarkerite järele, võtab valdkond üha enam kasutusele omics-meetodi, mis põhineb biomarkerite avastamise üldisel süsteemil. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance loodi 2014. aastal ja on programmi esirinnas. Selle riiklike tervishoiuinstituutide, akadeemiliste ringkondade ja tööstuse multidistsiplinaarse jõupingutuse eesmärk on kasutada süsteemipõhiseid strateegiaid AD patofüsioloogia paremaks määratlemiseks ning bioloogilise mitmekesisuse diagnostilise analüüsi ja ravistrateegiate väljatöötamiseks (10). Selle projekti osana on võrgu proteoomikast saanud paljulubav vahend süsteemipõhiste biomarkerite edendamiseks AD-s. See erapooletu andmepõhine lähenemine korraldab keerukad proteoomika andmekogumid koosekspresseeritud valkude rühmadesse või "moodulitesse", mis on seotud konkreetsete rakutüüpide, organellide ja bioloogiliste funktsioonidega (11-13). AD aju kohta on läbi viidud peaaegu 12 teaberikast võrguproteoomika uuringut (13–23). Üldiselt näitavad need analüüsid, et AD ajuvõrgu proteoom säilitab sõltumatutes kohortides ja mitmetes kortikaalsetes piirkondades kõrgelt konserveerunud modulaarse organisatsiooni. Lisaks näitavad mõned neist moodulitest reprodutseeritavaid muutusi AD-ga seotud arvukuses andmekogumite lõikes, peegeldades mitme haiguse patofüsioloogiat. Need leiud näitavad ühiselt paljutõotavat tugipunkti ajuvõrgu proteoomi kui süsteemipõhise biomarkerina avastamiseks AD-s.
AD ajuvõrgu proteoomi muutmiseks kliiniliselt kasulikeks süsteemipõhisteks biomarkeriteks ühendasime ajust pärineva võrgu AD CSF-i proteoomilise analüüsiga. Selle integreeritud lähenemisviisi tulemusel tuvastati viis paljulubavat CSF-i biomarkerite komplekti, mis on seotud paljude ajupõhise patofüsioloogiaga, sealhulgas sünapsid, veresooned, müelinisatsioon, põletik ja metaboolsete radade düsfunktsioon. Valideerisime need biomarkerite paneelid edukalt mitme replikatsioonianalüüsi abil, sealhulgas enam kui 500 CSF-proovi erinevatest neurodegeneratiivsetest haigustest. Need valideerimisanalüüsid hõlmavad asümptomaatilise AD (AsymAD) patsientide CSF-i rühma sihtmärkide uurimist või ebanormaalse amüloidi kogunemise tõendeid normaalses kognitiivses keskkonnas. Need analüüsid toovad esile AsymAD populatsiooni olulise bioloogilise heterogeensuse ja tuvastavad paneelimarkerid, mis võivad haiguse varases staadiumis isikuid alatüüpida. Üldiselt on need tulemused võtmetähtsusega sammu valgu biomarkeri tööriistade väljatöötamisel, mis põhinevad mitmel süsteemil, mis suudavad edukalt lahendada paljusid AD-ga silmitsi seisvaid kliinilisi väljakutseid.
Selle uuringu põhieesmärk on tuvastada uued tserebrospinaalvedeliku biomarkerid, mis kajastavad erinevaid ajupõhiseid patofüsioloogiaid, mis põhjustavad AD-d. Joonis S1 kirjeldab meie uurimismetoodikat, mis hõlmab (i) põhjalikku analüüsi, mis on ajendatud AD CSF-i esialgsetest leidudest ja võrgu ajuproteoomist, et tuvastada mitu ajuga seotud CSF-haiguse biomarkerit, ja (ii) järgnev replikatsioon. Need biomarkerid on mitmes sõltumatus tserebrospinaalsüsteemis. vedelad kohordid. Avastustele orienteeritud uuring algas Emory Goizueta Alzheimeri tõve uurimiskeskuses (ADRC) CSF erineva ekspressiooni analüüsiga 20 kognitiivselt normaalsel inimesel ja 20 AD-ga patsiendil. AD diagnoos on defineeritud kui oluline kognitiivne kahjustus madala Aβ1-42 ja kõrgenenud üld-tau ja p-tau juuresolekul tserebrospinaalvedelikus [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (tabel S1A). Kontrollil (keskmine MoCA, 26,7 ± 2,2) oli CSF-i biomarkerite tase normaalne.
Inimese CSF-i iseloomustab valkude arvukuse dünaamiline vahemik, milles albumiin ja muud äärmiselt rikkalikud valgud võivad takistada huvipakkuvate valkude tuvastamist (24). Valkude avastamise sügavuse suurendamiseks eemaldasime enne massispektromeetria (MS) analüüsi igast CSF-i proovist esimesed 14 väga rikkalikku valku (24). MS tuvastas kokku 39 805 peptiidi, mis kaardistati 3691 proteoomiga 40 proovis. Valgu kvantifitseerimine toimub mitme tandemmassmärgise (TMT) märgistamise teel (18, 25). Puuduvate andmete lahendamiseks kaasasime järgnevasse analüüsi ainult need valgud, mis kvantifitseeriti vähemalt 50% proovidest, kvantifitseerides seega lõpuks 2875 proteoomi. Seoses olulise erinevusega üldvalgu arvukuse tasemetes, peeti kontrollproovi statistiliselt kõrvalekalleks (13) ja seda ei kaasatud järgnevasse analüüsi. Ülejäänud 39 proovi arvukuse väärtusi kohandati vastavalt vanusele, soole ja partii kovariatsioonile (13-15, 17, 18, 20, 26).
Kasutades regressiooniandmete kogumi diferentsiaalse ekspressiooni hindamiseks statistilist t-testi analüüsi, tuvastas see analüüs valgud, mille arvukuse tase oli kontroll- ja AD juhtumite vahel oluliselt muutunud (P <0,05) (tabel S2A). Nagu on näidatud joonisel fig 1A, vähenes AD-s kokku 225 valgu arvukus oluliselt ja 303 valgu arvukus suurenes oluliselt. Need erinevalt ekspresseeritud valgud hõlmavad mitmeid varem tuvastatud tserebrospinaalvedeliku AD markereid, nagu mikrotuubulitega seotud valk tau (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), kasvuga seotud valk 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), rasvhappeid siduv valk 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), kitinaas 3 sarnane 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), närvigranuliin (NRGN; P = 3,43 × 10-4) ja VGF närvi kasvufaktor (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Siiski tuvastasime ka teisi väga olulisi sihtmärke, nagu SKT dissotsiatsiooni inhibiitor 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) ja SPARC-ga seotud modulaarne kaltsiumi sidumine 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). 225 oluliselt vähenenud valgu geeniontoloogia (GO) analüüs näitas tihedaid seoseid kehavedelike protsessidega, nagu steroidide metabolism, vere hüübimine ja hormoonide aktiivsus (joonis 1B ja tabel S2B). Seevastu 303 oluliselt suurenenud valk on tihedalt seotud raku struktuuri ja energia metabolismiga.
(A) Vulkaani graafik näitab log2-kordset muutust (x-telg) võrreldes -log10 statistilise P väärtusega (y-telg), mis on saadud t-testiga, mida kasutatakse diferentsiaalse ekspressiooni tuvastamiseks kontrolli (CT) ja Kõigi valkude CSF-i proteoomi AD juhtumid. Oluliselt vähenenud tasemega valgud (P <0, 05) AD-s on näidatud sinisega, samas kui valgud, mille tase on oluliselt suurenenud haiguse korral, on näidatud punasega. Valitud valk on märgistatud. (B) Valguga seotud peamised GO-terminid on AD-s oluliselt vähenenud (sinine) ja suurenenud (punane). Näitab kolme GO-terminit, millel on kõrgeim z-skoor bioloogiliste protsesside, molekulaarsete funktsioonide ja rakukomponentide valdkonnas. (C) MS mõõtis MAPT taset CSF proovis (vasakul) ja selle korrelatsiooni proovi ELISA tau tasemega (paremal). Kuvatakse Pearsoni korrelatsioonikordaja vastava P väärtusega. ELISA andmete puudumise tõttu ühe AD juhtumi kohta sisaldavad need arvud 39 analüüsitud juhtumist 38 väärtusi. (D) Kontrollitud klastrianalüüs (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) kohandatud P <0,01) kontrollis ja AD CSF-is leiti proovid, kasutades andmekogumis 65 enim muutunud valku. Standardiseeri, normaliseeri.
MAPT proteoomiline tase on tihedalt seotud sõltumatult mõõdetud ELISA tau tasemega (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; joonis 1C), mis toetab meie MS mõõtmise paikapidavust. Pärast trüpsiini lõhustamist amüloidi prekursorvalgu (APP) tasemel ei saa Aβ1-40 ja Aβ1-42 C-otsa kaardistatud isovormispetsiifilisi peptiide tõhusalt ioniseerida (27, 28). Seetõttu pole meie tuvastatud APP-peptiididel ELISA Aβ1-42 tasemetega midagi pistmist. Iga juhtumi diferentsiaalse ekspressiooni hindamiseks kasutasime proovide juhendatud klasteranalüüsi läbiviimiseks erinevalt ekspresseeritud valke, mille P <0,0001 [vale avastamise määr (FDR) korrigeeritud P <0,01] (tabel S2A). Nagu on näidatud joonisel fig 1D, võivad need 65 väga olulist valku proove õigesti rühmitada vastavalt haigusseisundile, välja arvatud üks kontrollisarnaste omadustega AD juhtum. Nendest 65 valgust suurenes 63 AD-s, samas kui ainult kaks (CD74 ja ISLR) vähenesid. Kokku on need tserebrospinaalvedeliku analüüsid tuvastanud AD-s sadu valke, mis võivad toimida haiguse biomarkeritena.
Seejärel teostasime AD aju proteoomi sõltumatu võrguanalüüsi. Selle avastuse ajugrupp hõlmas dorsolateraalset prefrontaalset ajukoort (DLPFC) kontrollist (n = 10), Parkinsoni tõbe (PD; n = 10), segatüüpi AD/PD (n = 10) ja AD (n = 10) juhtumeid. ) Näidis. Emery Goizueta ADRC. Nende 40 juhtumi demograafiat on eelnevalt kirjeldatud (25) ja need on kokku võetud tabelis S1B. Nende 40 ajukoe ja 27 juhtumi replikatsioonikohordi analüüsimiseks kasutasime TMT-MS-i. Kokku andsid need kaks aju andmekogumit 227 121 ainulaadset peptiidi, mis kaardistati 12 943 proteoomiga (25). Järgnevatesse uuringutesse kaasati ainult need valgud, mis kvantifitseeriti vähemalt 50% juhtudest. Lõplik avastamise andmekogum sisaldab 8817 kvantifitseeritud valku. Reguleerige valgu arvukuse taset vanuse, soo ja surmajärgse intervalli (PMI) alusel. Andmekogumi diferentsiaalekspressioonianalüüs pärast regressiooni näitas, et kahes või enamas haiguse kohordis muutusid >2000 valgu tase oluliselt [P <0,05, dispersioonanalüüs (ANOVA)]. Seejärel teostasime juhendatud klastrianalüüsi, mis põhines erinevalt ekspresseeritud valkudel ja P <0, 0001 AD / kontrolli ja / või AD / PD võrdlustes (joonis S2, A ja B, tabel S2C). Need 165 tugevalt muutunud valku kujutavad selgelt kontroll- ja PD-proovide AD-patoloogiaga juhtumeid, kinnitades tugevaid AD-spetsiifilisi muutusi kogu proteoomis.
Seejärel kasutasime avastatud ajuproteoomi võrguanalüüsi tegemiseks algoritmi nimega Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), mis korraldab andmestiku sarnaste ekspressioonimustritega valgumooduliteks (11–13). Analüüs tuvastas 44 moodulit (M) koosekspresseerinud valku, mis olid sorteeritud ja nummerdatud suurimatest (M1, n = 1821 valku) väikseimani (M44, n = 34 valku) (joonis 2A ja tabel S2D)). Nagu eespool mainitud (13) Arvutage iga mooduli tüüpiline ekspressiooniprofiil või iseloomulik valk ning korreleerige see haigusseisundi ja AD patoloogiaga, st määrake Alzheimeri tõve registri (CERAD) ja Braaki skoori liit (joonis 2B). Üldiselt oli 17 moodulit oluliselt seotud AD neuropatoloogiaga (P <0, 05). Paljud neist haigustega seotud moodulitest on rikkad ka rakutüübispetsiifiliste markerite poolest (joonis 2B). Nagu eespool mainitud (13), määratakse rakutüübi rikastamine mooduli kattumise ja rakutüübispetsiifiliste geenide võrdlusloendi analüüsimise teel. Need geenid on saadud avaldatud andmetest isoleeritud hiire neuronites, endoteeli- ja gliiarakkudes. RNA sekveneerimise (RNA-seq) katse (29).
(A) Avastage aju proteoomi WGCNA. (B) Modulaarse signatuurvalgu (modulaarse valgu ekspressiooni esimene põhikomponent) kahekaalulise keskkorrelatsiooni (BiCor) analüüs AD neuropatoloogiliste tunnustega (ülemine), sealhulgas CERAD (Aβ naast) ja Braak (tau sasipundar) skoor. Positiivsete (punane) ja negatiivsete (sinine) korrelatsioonide intensiivsus on näidatud kahevärvilise soojuskaardiga ning tärnid näitavad statistilist olulisust (P <0,05). Kasutage iga valgumooduli rakutüübi seose hindamiseks hüpergeomeetrilist Fisheri täpset testi (FET) (all). Punase varjundi intensiivsus näitab rakutüübi rikastamise astet ja tärn näitab statistilist olulisust (P <0,05). Kasutage BH-meetodit, et korrigeerida FET-ist tuletatud P väärtust. (C) Modulaarsete valkude GO analüüs. Iga mooduli või seotud moodulirühma jaoks on näidatud kõige tihedamalt seotud bioloogilised protsessid. oligo, oligodendrotsüüt.
Viie tihedalt seotud astrotsüütide ja mikrogliia rikka mooduli komplekt (M30, M29, M18, M24 ja M5) näitas tugevat positiivset korrelatsiooni AD neuropatoloogiaga (joonis 2B). Ontoloogiaanalüüs seob need gliaalmoodulid rakkude kasvu, proliferatsiooni ja immuunsusega (joonis 2C ja tabel S2E). Kaks täiendavat gliaalmoodulit M8 ja M22 on samuti haiguse korral tugevalt ülesreguleeritud. M8 on tihedalt seotud Toll-sarnase retseptori rajaga, signaaliülekande kaskaadiga, mis mängib kaasasündinud immuunvastuses võtmerolli (30). Samal ajal on M22 tihedalt seotud translatsioonijärgse modifikatsiooniga. M2, mis on rikas oligodendrotsüütide poolest, näitab tugevat positiivset korrelatsiooni AD patoloogiaga ja ontoloogilist seost nukleosiidide sünteesi ja DNA replikatsiooniga, mis näitab rakkude suurenenud proliferatsiooni haiguste korral. Üldiselt toetavad need leiud gliaalmoodulite tõusu, mida oleme varem AD-võrgu proteoomis täheldanud (13, 17). Praegu on leitud, et paljudel võrgus olevatel AD-ga seotud gliaalmoodulitel on kontroll- ja PD-juhtudel madalamad ekspressioonitasemed, mis toob esile nende haiguse spetsiifilisuse, mis on AD-s kõrgem (joonis S2C).
Ainult neli meie võrguproteoomi moodulit (M1, M3, M10 ja M32) on tugevalt negatiivses korrelatsioonis AD patoloogiaga (P <0,05) (joonis 2, B ja C). Nii M1 kui ka M3 on rikkad neuronaalsete markerite poolest. M1 on tihedalt seotud sünaptiliste signaalidega, samas kui M3 on tihedalt seotud mitokondriaalse funktsiooniga. Puuduvad tõendid M10 ja M32 rakutüübi rikastumisest. M32 peegeldab seost M3 ja raku metabolismi vahel, samas kui M10 on väga seotud rakkude kasvu ja mikrotuubulite funktsiooniga. Võrreldes AD-ga on kõigi nelja mooduli kontroll ja PD suurenenud, andes neile haigusspetsiifilised AD muutused (joonis S2C). Üldiselt toetavad need tulemused neuronirikaste moodulite arvu vähenemist, mida oleme varem täheldanud AD-s (13, 17). Kokkuvõttes andis meie avastatud aju proteoomi võrguanalüüs AD-spetsiifiliselt muudetud mooduleid, mis olid kooskõlas meie varasemate leidudega.
AD-le on iseloomulik varajane asümptomaatiline staadium (AsymAD), kus inimestel esineb amüloidi akumuleerumine ilma kliinilise kognitiivse languseta (5, 31). See asümptomaatiline staadium on varajase avastamise ja sekkumise kriitiline aken. Oleme varem näidanud AsymAD ja AD ajuvõrgu proteoomi tugevat modulaarset säilimist sõltumatutes andmekogumites (13, 17). Tagamaks, et praegu avastatud ajuvõrk on kooskõlas nende varasemate leidudega, analüüsisime 44 mooduli säilimist 27 DLPFC organisatsiooni replitseeritud andmekogumis. Need organisatsioonid hõlmavad kontroll- (n = 10), AsymAD (n = 8) ja AD (n = 9) juhtumeid. Kontroll- ja AD proovid kaasati meie avastusaju kohordi analüüsi (tabel S1B), samas kui AsymAD juhtumid olid ainulaadsed ainult replikatsioonikohordis. Need AsymAD juhtumid pärinesid ka Emory Goizueta ADRC ajupangast. Kuigi kognitsioon oli surma hetkel normaalne, oli amüloiditase ebanormaalselt kõrge (keskmine CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabel S1B).
Nende 27 ajukoe TMT-MS analüüs andis tulemuseks 11 244 proteoomi kvantifitseerimise. See lõplik arv hõlmab ainult neid valke, mis on kvantifitseeritud vähemalt 50% proovidest. See kopeeritud andmekogum sisaldab 8638 (98,0%) 8817 valgust, mis tuvastati meie avastusaju analüüsis, ja peaaegu 3000 oluliselt muutnud valku kontroll- ja AD-kohordi vahel (P <0,05, pärast Tukey paaris-t-testi dispersioonanalüüsiks) ( Tabel S2F). Nende erinevalt ekspresseeritud valkude hulgas näitas 910 ka olulisi muutusi AD ja aju proteoomi kontrolljuhtude vahel (P <0, 05, pärast ANOVA Tukey paaris-t-testi). Väärib märkimist, et need 910 markerid on proteoomide vahelise muutuse suunas väga järjepidevad (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (joonis S3A). Suurenenud valkude hulgas on kõige järjekindlamate andmete kogumite muutustega valgud peamiselt gliaalrikaste M5 ja M18 moodulite (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ja GFAP) liikmed. Vähendatud valkude hulgas olid kõige järjekindlamate muutustega need peaaegu eranditult sünapsiga seotud M1 mooduli liikmed (NPTX2, VGF ja RPH3A). Lisaks kontrollisime midkine'i (MDK), CD44, sekreteeritud frizzled-seotud valgu 1 (SFRP1) ja VGF AD-ga seotud muutusi Western blot analüüsiga (joonis S3B). Mooduli säilivusanalüüs näitas, et umbes 80% aju proteoomi valgumoodulitest (34/44) olid replikatsiooniandmete kogumis oluliselt konserveerunud (z-skoor> 1,96, FDR korrigeeritud P <0,05) (joonis S3C). Neliteist neist moodulitest olid spetsiaalselt reserveeritud kahe proteoomi vahel (z-skoor> 10, FDR korrigeeritud P <1,0 × 10-23). Üldiselt tõstab aju proteoomi vahelise erineva ekspressiooni ja modulaarse koostise kõrge järjepidevuse avastamine ja replikatsioon esile AD eesmise ajukoore valkude muutuste reprodutseeritavuse. Lisaks kinnitas see ka seda, et AsymAD-l ja kaugelearenenud haigustel on väga sarnane ajuvõrgu struktuur.
Aju replikatsiooniandmete kogumi diferentsiaalse ekspressiooni üksikasjalikum analüüs toob esile AsymAD valgu muutuste märkimisväärse taseme, sealhulgas kokku 151 oluliselt muutunud valku AsymAD ja kontrolli vahel (P <0, 05) (joonis S3D). Kooskõlas amüloidikoormusega suurenes APP AsymAD ja AD ajus märkimisväärselt. MAPT muutub märkimisväärselt ainult AD korral, mis on kooskõlas sasipundaride suurenenud tasemega ja selle teadaoleva korrelatsiooniga kognitiivse langusega (5, 7). Gliarikkad moodulid (M5 ja M18) kajastuvad AsymAD suurenenud valkudes, samas kui neuronitega seotud M1 moodul on AsymAD vähenenud valkude kõige tüüpilisem. Paljud neist AsymAD markeritest näitavad sümptomaatilistes haigustes suuremaid muutusi. Nende markerite hulgas on SMOC1, M18-sse kuuluv gliaalvalk, mida seostatakse ajukasvajate ning silmade ja jäsemete arenguga (32). MDK on hepariini siduv kasvufaktor, mis on seotud rakkude kasvu ja angiogeneesiga (33), teine M18 liige. Võrreldes kontrollrühmaga suurenes AsymAD märkimisväärselt, millele järgnes suurem AD suurenemine. Seevastu sünaptiline valk neuropentraksiin 2 (NPTX2) vähenes AsymAD ajus märkimisväärselt. NPTX2 oli varem seotud neurodegeneratsiooniga ja sellel on tunnustatud roll ergastavate sünapside vahendamisel (34). Üldiselt näitavad need tulemused mitmesuguseid AD prekliinilisi valgu muutusi, mis näivad progresseeruvat koos haiguse tõsidusega.
Arvestades, et oleme aju proteoomi avastamisel saavutanud märkimisväärse valgukatte sügavuse, püüame paremini mõista selle kattumist võrgutaseme AD transkriptoomiga. Seetõttu võrdlesime avastatud ajuproteoomi mooduliga, mille genereerisime varem 18 204 geeni mikrokiibi mõõtmisel AD (n = 308) ja kontroll (n = 157) DLPFC kudedes (13). kattuvad. Kokku tuvastasime 20 erinevat RNA moodulit, millest paljud näitasid spetsiifiliste rakutüüpide, sealhulgas neuronite, oligodendrotsüütide, astrotsüütide ja mikroglia rikastamist (joonis 3A). Nende moodulite mitmed muudatused AD-s on näidatud joonisel 3B. Kooskõlas meie eelmise valgu-RNA kattuvuse analüüsiga, milles kasutati sügavamat märgistamata MS-i proteoomi (umbes 3000 valku) (13), on enamik leitud aju proteoomivõrgu 44 moodulist transkriptoomivõrgus. Olulist kattumist ei esine. Meie avastamisel ja replikatsioonil 34 valgumoodulit, mis on aju proteoomides tugevalt säilinud, osutus ainult 14 (~ 40%) Fisheri täpse testi (FET) läbinud statistiliselt oluliseks kattumiseks transkriptoomiga (joonis 3A). Ühildub DNA kahjustuste parandamise (P-M25 ja P-M19), valgu translatsiooni (P-M7 ja P-M20), RNA sidumise/splaissimisega (P-M16 ja P-M21) ja valgu sihtimisega (P-M13 ja P- M23) ei kattu ärakirja moodulitega. Seetõttu, kuigi praeguses kattuvuse analüüsis (13) kasutatakse sügavamat proteoomide andmekogumit, ei ole suurem osa AD-võrgu proteoomist transkriptoomivõrguga kaardistatud.
(A) Hüpergeomeetriline FET näitab rakutüübispetsiifiliste markerite rikastumist AD transkriptoomi RNA moodulis (ülemine) ja AD aju RNA (x-telg) ja valgu (y-telg) moodulite kattumise astet. (all) . Punase varjundi intensiivsus näitab ülemise paneeli rakutüüpide rikastamise astet ja alumise paneeli moodulite kattumise intensiivsust. Tärnid näitavad statistilist olulisust (P <0,05). (B) Iga transkriptoomimooduli iseloomulike geenide ja AD staatuse vaheline korrelatsiooniaste. Vasakpoolsed moodulid on kõige negatiivsemalt korrelatsioonis AD-ga (sinine) ja parempoolsed on kõige positiivsemalt korrelatsioonis AD-ga (punane). Log-transformeeritud BH-korrigeeritud P väärtus näitab iga korrelatsiooni statistilise olulisuse astet. (C) Märkimisväärsed kattuvad moodulid jagatud rakutüübi rikastamisega. (D) Märgistatud valgu (x-telg) ja RNA (y-telg) log2-kordse muutuse korrelatsioonianalüüs kattuvas moodulis. Kuvatakse Pearsoni korrelatsioonikordaja vastava P väärtusega. Mikro-, mikroglia; taevakehad, astrotsüüdid. CT, kontroll.
Enamikul kattuvatel valgu- ja RNA moodulitel on sarnased rakutüübi rikastamisprofiilid ja järjepidevad AD muutumissuunad (joonis 3, B ja C). Teisisõnu, aju proteoomi (PM1) sünapsiga seotud M1 moodul on kaardistatud kolme neuronirikka homoloogse RNA mooduliga (R-M1, R-M9 ja R-M16), mis on AD-s. Mõlemad näitasid. vähendatud tase. Samamoodi kattuvad gliiarikkad M5 ja M18 valgumoodulid RNA moodulitega, mis on rikkad astrotsüütide ja mikrogliia markerite poolest (R-M3, R-M7 ja R-M10) ning on väga seotud haigustega. Need jagatud modulaarsed funktsioonid kahe andmekogumi vahel toetavad veelgi rakutüübi rikastamist ja haigustega seotud muutusi, mida oleme aju proteoomis täheldanud. Siiski täheldasime nendes jagatud moodulites üksikute markerite RNA ja valgu taseme vahel palju olulisi erinevusi. Nendes kattuvates moodulites olevate molekulide proteoomika ja transkriptoomika diferentsiaalse ekspressiooni korrelatsioonianalüüs (joonis 3D) toob selle ebakõla esile. Näiteks APP ja mitmed teised gliaalmooduli valgud (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ja SFRP1) näitasid AD proteoomi olulist suurenemist, kuid AD transkriptoomis peaaegu ei toimunud muutusi. Need valgu-spetsiifilised muutused võivad olla tihedalt seotud amüloidnaastudega (23, 35), tuues esile proteoomi kui patoloogiliste muutuste allika ja need muutused ei pruugi kajastuda transkriptoomis.
Pärast avastatud aju ja CSF-i proteoomide sõltumatut analüüsimist viisime läbi kahe andmekogumi põhjaliku analüüsi, et tuvastada ajuvõrgu patofüsioloogiaga seotud AD CSF-i biomarkerid. Kõigepealt peame määratlema kahe proteoomi kattuvuse. Kuigi on laialdaselt aktsepteeritud, et CSF peegeldab neurokeemilisi muutusi AD ajus (4), on AD aju ja CSF-i proteoomi täpne kattumise määr ebaselge. Võrreldes meie kahes proteoomis tuvastatud jagatud geeniproduktide arvu, leidsime, et peaaegu 70% (n = 1936) tserebrospinaalvedelikus tuvastatud valkudest kvantifitseeriti ka ajus (joonis 4A). Enamik neist kattuvatest valkudest (n = 1721) on kaardistatud avastusaju andmekogumist ühega 44-st koekspressioonimoodulist (joonis 4B). Nagu oodatud, kattusid kuus suurimat ajumoodulit (M1 kuni M6) kõige rohkem CSF-i. Siiski on väiksemaid ajumooduleid (näiteks M15 ja M29), mis saavutavad ootamatult suure kattuvuse, mis on suurem kui kaks korda suurem ajumoodul. See motiveerib meid kasutama üksikasjalikumat, statistiliselt juhitud meetodit aju ja tserebrospinaalvedeliku vahelise kattuvuse arvutamiseks.
(A ja B) Avastusaju ja CSF-i andmekogumites tuvastatud valgud kattuvad. Enamik neist kattuvatest valkudest on seotud ühega aju kaasekspressioonivõrgu 44-st koekspressioonimoodulist. (C) Avastage tserebrospinaalvedeliku proteoomi ja ajuvõrgu proteoomi kattumine. Soojuskaardi iga rida kujutab endast hüpergeomeetrilise FET-i eraldi kattumise analüüsi. Ülemine rida kujutab kattumist (hall/must varjund) ajumooduli ja kogu CSF-i proteoomi vahel. Teine rida kujutab, et ajumoodulite ja CSF-valgu (punase varjundiga) kattumine on AD-s oluliselt ülesreguleeritud (P <0, 05). Kolmas rida näitab, et ajumoodulite ja CSF-valgu (sinine varjund) kattumine on AD korral oluliselt alla reguleeritud (P <0, 05). Kasutage BH-meetodit, et korrigeerida FET-ist tuletatud P väärtust. (D) Kokkupandav moodulpaneel, mis põhineb rakutüübi seosel ja sellega seotud GO terminitel. Need paneelid sisaldavad kokku 271 ajuga seotud valku, millel on CSF-i proteoomides oluline erinev ekspressioon.
Ühepoolseid FET-e kasutades hindasime CSF-i proteoomi ja üksikute ajumoodulite vahelise valkude kattumise tähtsust. Analüüs näitas, et CSF-i andmekogus on kokku 14 ajumoodulil statistiliselt olulisi kattumisi (FDR-iga korrigeeritud P <0,05) ja täiendaval moodulil (M18), mille kattumine on olulisuse lähedal (FDR-iga kohandatud P = 0,06) (joonis 4C). , ülemine rida). Oleme huvitatud ka moodulitest, mis kattuvad tugevalt erinevalt ekspresseeritud CSF-valkudega. Seetõttu rakendasime kahte täiendavat FET-analüüsi, et teha kindlaks, milline (i) CSF-valgust oli AD korral oluliselt suurenenud ja (ii) CSF-valk vähenes oluliselt AD-s (P <0,05, paaris t-test AD/kontroll) ajumoodulid, millel on oluline kattumine nende vahel. Nagu on näidatud joonise 4C keskmisel ja alumisel real, näitavad need täiendavad analüüsid, et 44 ajumoodulist 8 kattuvad oluliselt AD CSF-i lisatud valguga (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ja M38). . ), samas kui ainult kaks moodulit (M6 ja M15) näitasid olulist kattumist AD CSF-i vähenenud valguga. Nagu oodatud, on kõik 10 moodulit 15 moodulis, millel on CSF-i proteoomiga suurim kattuvus. Seetõttu eeldame, et need 15 moodulit on AD ajust pärinevate CSF-i biomarkerite suure tootlikkusega allikad.
Voltisime need 15 kattuvat moodulit viieks suureks valgupaneeliks, võttes aluseks nende läheduse WGCNA puudiagrammis ja nende seose rakutüüpide ja geeniontoloogiaga (joonis 4D). Esimene paneel sisaldab mooduleid, mis on rikkad neuronimarkerite ja sünapsiga seotud valkude (M1 ja M12) poolest. Sünaptiline paneel sisaldab kokku 94 valku ja CSF-i proteoomi tasemed on oluliselt muutunud, muutes selle viie paneeli hulgas suurimaks ajuga seotud CSF-markerite allikaks. Teine rühm (M6 ja M15) näitas tihedat seost endoteelirakkude markerite ja vaskulaarse kehaga, nagu "haavade paranemine" (M6) ja "humoraalse immuunvastuse reguleerimine" (M15). M15 on samuti tihedalt seotud lipoproteiinide metabolismiga, mis on tihedalt seotud endoteeliga (36). Vaskulaarne paneel sisaldab 34 ajuga seotud CSF-markerit. Kolmas rühm sisaldab mooduleid (M2 ja M4), mis on oluliselt seotud oligodendrotsüütide markerite ja rakkude proliferatsiooniga. Näiteks M2 tipptasemel ontoloogiaterminid hõlmavad "DNA replikatsiooni positiivset reguleerimist" ja "puriini biosünteesi protsessi". Samal ajal hõlmavad M4 omad "gliiarakkude diferentseerumist" ja "kromosoomide segregatsiooni". Müelinisatsioonipaneel sisaldab 49 ajuga seotud CSF-markerit.
Neljas rühm sisaldab kõige rohkem mooduleid (M30, M29, M18, M24 ja M5) ning peaaegu kõik moodulid on oluliselt rikkad mikrogliia ja astrotsüütide markerite poolest. Sarnaselt müelinisatsioonipaneeliga sisaldab neljas paneel ka mooduleid (M30, M29 ja M18), mis on tihedalt seotud rakkude proliferatsiooniga. Teised selle rühma moodulid on tugevalt seotud immunoloogiliste terminitega, nagu "immuunmõju protsess" (M5) ja "immuunvastuse reguleerimine" (M24). Gliaalne immuunrühm sisaldab 42 ajuga seotud CSF-markerit. Lõpuks sisaldab viimane paneel 52 ajuga seotud markerit neljal moodulil (M44, M3, M33 ja M38), mis kõik on kehal seotud energia salvestamise ja ainevahetusega. Suurim neist moodulitest (M3) on tihedalt seotud mitokondritega ja on rikas neuronispetsiifiliste markerite poolest. M38 on selle metaboloomi üks väiksemaid mooduliliikmeid ja sellel on ka mõõdukas neuronite spetsiifilisus.
Üldiselt peegeldavad need viis paneeli laia valikut rakutüüpe ja funktsioone AD ajukoores ning sisaldavad ühiselt 271 ajuga seotud CSF-markerit (tabel S2G). Nende MS-i tulemuste paikapidavuse hindamiseks kasutasime läheduse laiendamise analüüsi (PEA), ortogonaalsel antikehal põhinevat multipleksimisvõimega, kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega tehnoloogiat ning analüüsisime uuesti tserebrospinaalvedeliku proove, mille leidsime nende 271 biomarkeri alamhulga. (n = 36). Need 36 sihtmärki näitavad PEA AD-kordaja muutust, mis on tihedalt seotud meie MS-põhiste leidudega (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), mis kinnitas tugevalt meie põhjaliku MS-analüüsi tulemusi (joonis S4). ).
Meie viie rühma rõhutatud bioloogilised teemad, alates sünaptilisest signaalimisest kuni energia metabolismini, on kõik seotud AD patogeneesiga (1–3). Seetõttu on kõik neid paneele sisaldavad 15 moodulit seotud AD patoloogiaga aju proteoomis, mille me avastasime (joonis 2B). Kõige tähelepanuväärsem on kõrge positiivne patoloogiline korrelatsioon meie gliaalmoodulite vahel ja tugev negatiivne patoloogiline korrelatsioon meie suurimate neuronaalsete moodulite (M1 ja M3) vahel. Meie replitseeritud ajuproteoomi diferentsiaalekspressioonianalüüs (joonis S3D) tõstab esile ka M5 ja M18-st pärinevad gliaalvalgud. AsymAD ja sümptomaatilise AD korral on kõige rohkem suurenenud gliaalvalgud ja M1-ga seotud sünapsid. Valk väheneb kõige rohkem. Need tähelepanekud näitavad, et 271 tserebrospinaalvedeliku markerit, mille me viies rühmas tuvastasime, on seotud haigusprotsessidega AD ajukoores, sealhulgas nendega, mis esinevad varajases asümptomaatilises staadiumis.
Paneelvalkude muutumissuuna paremaks analüüsimiseks ajus ja seljaajuvedelikus joonistasime iga 15 kattuva mooduli kohta järgmise: (i) leidsime mooduli arvukuse taseme aju andmekogumis ja (ii) mooduli. valk Erinevus väljendub tserebrospinaalvedelikus (joonis S5). Nagu varem mainitud, kasutatakse WGCNA-d mooduli arvukuse või iseloomuliku valgu väärtuse määramiseks ajus (13). Vulkaanikaarti kasutatakse modulaarsete valkude erineva ekspressiooni kirjeldamiseks tserebrospinaalvedelikus (AD/kontroll). Need arvud näitavad, et kolm viiest paneelist näitavad erinevaid ekspressioonisuundumusi ajus ja seljaajus. Sünapsipaneeli kaks moodulit (M1 ja M12) näitavad AD aju arvukuse taseme langust, kuid kattuvad märkimisväärselt AD CSF-i suurenenud valguga (joonis S5A). Neuronidega seotud moodulid, mis sisaldavad metaboomi (M3 ja M38), näitasid sarnaseid aju ja tserebrospinaalvedeliku ekspressioonimustreid, mis olid vastuolulised (joonis S5E). Veresoonte paneel näitas ka erinevaid ekspressioonisuundumusi, kuigi selle moodulid (M6 ja M15) olid AD ajus mõõdukalt suurenenud ja haigestunud CSF-is vähenenud (joonis S5B). Ülejäänud kaks paneeli sisaldavad suuri gliaalvõrke, mille valgud on mõlemas sektsioonis pidevalt ülesreguleeritud (joonis S5, C ja D).
Pange tähele, et need suundumused ei ole nende paneelide kõigi markerite jaoks ühised. Näiteks sisaldab sünaptiline paneel mitmeid valke, mis on AD ajus ja CSF-is oluliselt vähenenud (joonis S5A). Nende allareguleeritud tserebrospinaalvedeliku markerite hulgas on M1 NPTX2 ja VGF ning M12 kromograniin B. Kuid hoolimata nendest eranditest on enamikul meie sünaptilistest markeritest AD seljaaju vedelikus kõrgenenud. Üldiselt suutsid need analüüsid eristada statistiliselt olulisi suundumusi aju ja tserebrospinaalvedeliku tasemes kõigis meie viies paneelis. Need suundumused toovad esile keeruka ja sageli erineva seose aju ja CSF-valgu ekspressiooni vahel AD-s.
Seejärel kasutasime suure läbilaskevõimega MS-i replikatsioonianalüüsi (CSF-i replikatsioon 1), et kitsendada oma 271 biomarkeri komplekti kõige lootustandvamatele ja reprodutseeritavamatele sihtmärkidele (joonis 5A). CSF-i koopia 1 sisaldab kokku 96 Emory Goizueta ADRC proovi, sealhulgas kontroll-, AsymAD- ja AD-kohordi (tabel S1A). Neid AD juhtumeid iseloomustab kerge kognitiivne langus (keskmine MoCA, 20, 0 ± 3, 8) ja AD biomarkerite muutused, mis on kinnitatud tserebrospinaalvedelikus (tabel S1A). Vastupidiselt leitud CSF-analüüsile tehakse see replikatsioon tõhusama ja suurema läbilaskevõimega ühekordse MS-meetodiga (ilma võrguühenduseta fraktsioneerimiseta), sealhulgas lihtsustatud proovi ettevalmistamise protokolliga, mis välistab vajaduse üksikute proovide immuunpuudulikkuse järele. . Selle asemel kasutatakse vähem rikkalike valkude signaali võimendamiseks ühte nõrgenenud immuunsüsteemi (37). Kuigi see vähendab proteoomide kogukatvust, vähendab see ühe võttega meetod märkimisväärselt masina tööaega ja suurendab elujõuliseks analüüsitavate TMT-märgisega proovide arvu (17, 38). Kokku tuvastas analüüs 6487 peptiidi, mis kaardistati 96 juhul 1183 proteoomiga. Nagu ka meie leitud CSF-analüüsi puhul, kaasati järgmistesse arvutustesse ainult need valgud, mis olid kvantifitseeritud vähemalt 50% proovidest, ning andmed taandati vanuse ja soo mõjude suhtes. See viis lõpliku kvantifitseerimiseni 792 proteoomi kohta, millest 95% tuvastati ka leitud CSF-i andmekogumis.
(A) Ajuga seotud CSF-valgu sihtmärgid, mida kontrolliti esimeses korduva CSF-i kohordis ja kaasati lõpppaneeli (n = 60). (B kuni E) Paneeli biomarkerite tasemed (liit-z-skoorid), mida mõõdetakse neljas CSF-i replikatsioonikohordis. Iga kordusanalüüsi arvukuse muutuste statistilise olulisuse hindamiseks kasutati paaris t-teste või ANOVA-d Tukey järelkorrektsiooniga. CT, kontroll.
Kuna oleme eriti huvitatud oma 271 ajuga seotud CSF-i sihtmärgi kontrollimisest põhjaliku analüüsi kaudu, piirame selle replitseeritud proteoomi edasist uurimist nende markeritega. Nendest 271 valgu hulgast tuvastati 100 CSF replikatsioonis 1. Joonis S6A näitab nende 100 kattuva markeri erinevat ekspressiooni kontroll- ja AD replikatsiooniproovide vahel. Sünaptilised ja metaboliitide histoonid suurenevad kõige rohkem AD korral, samas kui veresoonte valgud vähenevad kõige rohkem haiguste korral. Enamik 100 kattuvast markerist (n = 70) säilitas kahes andmekogumis sama muutuse suuna (joonis S6B). Need 70 valideeritud ajuga seotud CSF-markerit (tabel S2H) peegeldavad suures osas varem täheldatud paneeli ekspressioonitrende, st vaskulaarsete valkude allareguleerimist ja kõigi teiste paneelide ülesreguleerimist. Ainult 10 neist 70 valideeritud valgust näitasid AD arvukuse muutusi, mis olid nende paneeli suundumustega vastuolus. Aju ja tserebrospinaalvedeliku üldist suundumust kõige paremini kajastava paneeli loomiseks jätsime need 10 valku huvipakkuvast paneelist välja, mille lõpuks kontrollisime (joonis 5A). Seetõttu sisaldab meie paneel lõpuks kokku 60 valku, mida kontrolliti kahes sõltumatus CSF AD kohordis, kasutades erinevat proovide ettevalmistamist ja MS platvormi analüüsi. Nende lõplike paneelide z-skoori ekspressioonigraafikud CSF-i koopia 1 kontroll- ja AD-juhtumites kinnitasid meie leitud CSF-i kohordis täheldatud paneeli suundumust (joonis 5B).
Nende 60 valgu hulgas on teadaolevalt AD-ga seotud molekule, nagu osteopontiin (SPP1), mis on põletikuvastane tsütokiin, mida on paljudes uuringutes seostatud AD-ga (39–41), ja GAP43, A sünaptiline valk. mis on selgelt seotud neurodegeneratsiooniga (42). Kõige täielikult kontrollitud valgud on markerid, mis on seotud teiste neurodegeneratiivsete haigustega, nagu amüotroofse lateraalskleroosiga (ALS) seotud superoksiiddismutaas 1 (SOD1) ja Parkinsoni tõvega seotud desahharaas (PARK7). Samuti oleme kontrollinud, et paljudel teistel markeritel, nagu SMOC1 ja ajurikkal membraani kinnitusvalgul 1 (BASP1), on varasemad seosed neurodegeneratsiooniga piiratud. Väärib märkimist, et nende vähese üldise arvukuse tõttu CSF-i proteoomis on meil raske kasutada seda suure läbilaskevõimega ühekordse tuvastamise meetodit MAPT ja teatud teiste AD-ga seotud valkude (näiteks NEFL ja NRGN) usaldusväärseks tuvastamiseks. ) ( 43, 44).
Seejärel kontrollisime neid 60 prioriteetse paneeli markerit kolmes täiendavas kordusanalüüsis. CSF-i koopias 2 kasutasime ühte TMT-MS-i, et analüüsida Emory Goizueta ADRC (17) 297 kontroll- ja AD proovist koosnevat sõltumatut rühma. CSF replikatsioon 3 hõlmas saadaolevate TMT-MS andmete uuesti analüüsi 120 kontroll- ja AD-patsiendilt Lausanne'ist, Šveitsist (45). Tuvastasime igas andmekogumis enam kui kaks kolmandikku 60 prioriteetsest markerist. Kuigi Šveitsi uuringus kasutati erinevaid MS-i platvorme ja TMT kvantifitseerimismeetodeid (45, 46), kordasime kahes korduvas analüüsis tugevalt oma paneeli suundumusi (joonis 5, C ja D ning tabelid S2, I ja J). Meie rühma haigusspetsiifilisuse hindamiseks kasutasime TMT-MS-i, et analüüsida neljandat replikatsiooni andmestikku (CSF replikatsioon 4), mis hõlmas mitte ainult kontroll- (n = 18) ja AD (n = 17) juhtumeid, vaid ka PD ( n = 14), ALS-i (n = 18) ja frontotemporaalse dementsuse (FTD) proovid (n = 11) (tabel S1A). Kvantifitseerisime edukalt peaaegu kaks kolmandikku paneelivalkudest selles kohordis (38 60-st). Need tulemused toovad esile AD-spetsiifilised muutused kõigis viies biomarkeri paneelis (joonis 5E ja tabel S2K). Metaboliitrühma suurenemine näitas tugevaimat AD-spetsiifilisust, millele järgnesid müelinisatsiooni- ja gliiarühm. Vähemal määral näitab FTD nende paneelide vahel ka kasvu, mis võib kajastada sarnaseid võimalikke võrgumuudatusi (17). Seevastu ALS ja PD näitasid peaaegu samu müelinisatsiooni, gliia ja metaboolseid profiile kui kontrollrühmal. Üldiselt näitavad need korduvad analüüsid proovide ettevalmistamise, MS platvormi ja TMT kvantifitseerimismeetodite erinevustest hoolimata, et meie prioriteetsetel paneelimarkeritel on enam kui 500 ainulaadses CSF-proovis väga järjepidevad AD-spetsiifilised muutused.
AD neurodegeneratsiooni on laialdaselt tunnustatud juba mitu aastat enne kognitiivsete sümptomite ilmnemist, seega on tungiv vajadus AsymAD biomarkerite järele (5, 31). Üha enam tõendeid näitab aga, et AsymAD bioloogia pole kaugeltki homogeenne ning riski ja vastupidavuse kompleksne koostoime põhjustab suuri individuaalseid erinevusi haiguse edasises progresseerumises (47). Kuigi seda kasutatakse AsymAD juhtude tuvastamiseks, ei ole CSF-i biomarkerite (Aβ1-42, kogu tau ja p-tau) tasemed suutnud usaldusväärselt ennustada, kes areneb dementsusse (4, 7), mis näitab, et see võib olla Selle populatsiooni riski täpseks stratifitseerimiseks on vaja kaasata terviklikud biomarkeri tööriistad, mis põhinevad aju füsioloogia mitmel aspektil. Seetõttu analüüsisime seejärel oma AD-valideeritud biomarkerite paneeli CSF koopia 1 AsymAD populatsioonis. Need 31 AsymAD juhtumit näitasid ebanormaalset põhibiomarkeri taset (Aβ1–42 / kogu tau ELISA suhe, <5,5) ja täielikku tunnetust (keskmine MoCA, 27,1). ± 2,2) (tabel S1A). Lisaks on kõigil AsymAD-ga isikutel kliiniline dementsuse skoor 0, mis näitab, et puuduvad tõendid igapäevase kognitiivse või funktsionaalse jõudluse languse kohta.
Esmalt analüüsisime valideeritud paneelide taset kõigis 96 CSF-i korduses 1, sealhulgas AsymAD kohordis. Leidsime, et AsymAD rühma mitmel paneelil olid märkimisväärsed AD-laadsed arvukuse muutused, veresoonte paneel näitas AsymAD langustrendi, samas kui kõik teised paneelid näitasid tõusutrendi (joonis 6A). Seetõttu näitasid kõik paneelid väga olulist korrelatsiooni ELISA Aβ1-42 ja tau kogutasemega (joonis 6B). Seevastu korrelatsioon rühma ja MoCA skoori vahel on suhteliselt halb. Üks nende analüüside silmatorkavamaid leide on AsymAD-i kohorti paneelide arvukus. Nagu on näidatud joonisel 6A, ületab AsymAD rühma paneelitase tavaliselt kontrollrühma ja AD rühma paneeli taset, näidates suhteliselt suurt varieeruvust. AsymAD selle heterogeensuse edasiseks uurimiseks rakendasime mitmemõõtmelise skaleerimise (MDS) analüüsi 96 CSF replikatsiooni 1 juhtumile. MDS-analüüs võimaldab visualiseerida juhtumite sarnasust, tuginedes andmekogumi teatud muutujatele. Selle klastrianalüüsi jaoks kasutame ainult neid valideeritud paneelimarkereid, millel on statistiliselt oluline muutus (P <0,05, AD/kontroll) CSF-i avastamise ja replikatsiooni 1 proteoomi (n = 29) (tabel S2L) tasemel. See analüüs andis selge ruumilise rühmituse meie kontrolli ja AD juhtumite vahel (joonis 6C). Seevastu mõned AsymAD juhtumid on selgelt koondunud kontrollrühma, samas kui teised asuvad AD juhtumites. Selle AsymAD heterogeensuse edasiseks uurimiseks kasutasime nende AsymAD juhtumite kahe rühma määratlemiseks oma MDS-kaarti. Esimesse rühma kuulusid AsymAD juhtumid, mis olid koondunud kontrollile lähemale (n = 19), samas kui teist rühma iseloomustasid AsymAD juhtumid, mille markerprofiil oli AD-le lähemal (n = 12).
(A) CSF-i biomarkerite rühma ekspressioonitase (z-skoor) kõigis 96 proovis CSF-i replikatsiooni 1. kohordis, sealhulgas AsymAD. Paneelide arvukuse muutuste statistilise olulisuse hindamiseks kasutati dispersioonanalüüsi Tukey järelkorrektsiooniga. (B) Paneelvalgu arvukuse taseme (z-skoor) korrelatsioonianalüüs MoCA skoori ja kogu tau tasemega ELISA Aβ1-42 ja CSF koopia 1 proovides. Kuvatakse Pearsoni korrelatsioonikordaja vastava P väärtusega. (C) 96 CSF 1. koopia juhtumi MDS põhines 29 valideeritud paneelimarkeri arvukuse tasemetel, mis olid oluliselt muutunud nii avastuse kui ka CSF koopia 1 andmekogumis [P <0,05 AD/kontroll (CT)]. Seda analüüsi kasutati AsymAD rühma jagamiseks kontroll- (n = 19) ja AD (n = 12) alarühmadeks. (D) Vulkaani graafik näitab kõigi CSF replikatsiooni 1 valkude erinevat ekspressiooni log2-kordse muutusega (x-telg) võrreldes -log10 statistilise P väärtusega kahe AsymAD alarühma vahel. Paneeli biomarkerid on värvilised. (E) Valikurühma biomarkerite CSF replikatsiooni 1 arvukuse tase on AsymAD alarühmade vahel erinevalt ekspresseeritud. Statistilise olulisuse hindamiseks kasutati Tukey järelkorrigeeritud dispersioonanalüüsi.
Uurisime nende kontroll- ja AD-sarnaste AsymAD-juhtude vahelist erinevat valguekspressiooni (joonis 6D ja tabel S2L). Saadud vulkaanikaart näitab, et 14 paneelimarkerit on kahe rühma vahel oluliselt muutunud. Enamik neist markeritest on sünapsi ja metaboloomi liikmed. Kuid sellesse rühma kuuluvad ka SOD1 ja müristoüülitud alaniinirikas proteiinkinaasi C substraat (MARCKS), mis on vastavalt müeliini ja gliaalse immuunrühma liikmed (joonis 6, D ja E). Veresoonte paneel sisaldas ka kahte markerit, mis olid AD-sarnases AsymAD rühmas märkimisväärselt vähenenud, sealhulgas AE-d siduv valk 1 (AEBP1) ja komplemendi perekonnaliige C9. ELISA AB1-42 (P = 0,38) ja p-tau (P = 0,28) analüüsis kontroll- ja AD-sarnaste AsymAD alarühmade vahel olulist erinevust ei ilmnenud, kuid kogu tau tasemes oli tõepoolest oluline erinevus (P = 0,0031). ) (joonis S7). On mitmeid paneelimarkereid, mis näitavad, et muutused kahe AsymAD alarühma vahel on olulisemad kui tau kogutasemed (näiteks YWHAZ, SOD1 ja MDH1) (joonis 6E). Üldiselt näitavad need tulemused, et meie valideeritud paneel võib sisaldada biomarkereid, mis võivad asümptomaatilise haigusega patsientide alatüüpi ja potentsiaalset riskikihti jagada.
Hädasti on vaja süsteemipõhiseid biomarkeri tööriistu, et paremini mõõta ja sihtida erinevaid AD taga olevaid patofüsioloogiaid. Eeldatakse, et need vahendid mitte ainult ei muuda meie AD diagnostikaraamistikku, vaid soodustavad ka tõhusate, patsiendispetsiifiliste ravistrateegiate vastuvõtmist (1, 2). Selleks rakendasime AD aju ja CSF-i suhtes erapooletut terviklikku proteoomika lähenemisviisi, et tuvastada veebipõhised CSF-i biomarkerid, mis kajastavad laia valikut ajupõhist patofüsioloogiat. Meie analüüs andis viis CSF-i biomarkeri paneeli, mis (i) peegeldavad sünapse, veresooni, müeliini, immuun- ja metaboolset düsfunktsiooni; ii) demonstreerima tugevat reprodutseeritavust erinevatel MS platvormidel; (iii) Näidake progresseeruvaid haigusspetsiifilisi muutusi AD varases ja hilises staadiumis. Üldiselt kujutavad need leiud paljutõotavat sammu AD-uuringute ja kliiniliste rakenduste jaoks mitmekesiste, usaldusväärsete, veebipõhise biomarkeri tööriistade väljatöötamise suunas.
Meie tulemused näitavad AD ajuvõrgu proteoomi väga konserveerunud korraldust ja toetavad selle kasutamist süsteemipõhise biomarkerite arendamise ankruna. Meie analüüs näitab, et kahel sõltumatul TMT-MS andmestikul, mis sisaldavad AD ja AsymAD aju, on tugev modulaarsus. Need leiud laiendavad meie varasemat tööd, näidates enam kui 2000 ajukoe võimsate moodulite säilimist mitmest sõltumatust kohordist eesmises, parietaalses ja ajalises ajukoores (17). See konsensusvõrgustik peegeldab mitmesuguseid praegustes uuringutes täheldatud haigustega seotud muutusi, sealhulgas gliaalrikaste põletikuliste moodulite suurenemist ja neuronirikaste moodulite vähenemist. Nagu praegused uuringud, sisaldab see laiaulatuslik võrgustik ka olulisi modulaarseid muutusi AsymAD-is, mis näitab mitmesuguseid prekliinilisi patofüsioloogiaid (17).
Kuid selles väga konservatiivses süsteemipõhises raamistikus on rohkem peeneteralist bioloogilist heterogeensust, eriti AD varases staadiumis olevate isikute seas. Meie biomarkeri paneel suudab AsymAD-is kujutada kahte alarühma, mis näitavad mitme CSF-markeri olulist erinevat ekspressiooni. Meie rühm suutis esile tuua nende kahe alarühma vahelised bioloogilised erinevused, mis ei olnud AD põhibiomarkerite tasemel ilmsed. Võrreldes kontrollrühmaga oli nende AsymAD indiviidide Aβ1-42/tau kogu suhe ebanormaalselt madal. Kuid ainult tau kogutasemed olid kahe AsymAD alarühma vahel oluliselt erinevad, samas kui Aβ1-42 ja p-tau tasemed jäid suhteliselt võrreldavaks. Kuna kõrge CSF tau näib olevat parem kognitiivsete sümptomite ennustaja kui Aβ1-42 tase (7), kahtlustame, et kahel AsymAD kohortil võivad haiguse progresseerumise riskid olla erinevad. Arvestades meie AsymAD-i piiratud valimi suurust ja pikisuunaliste andmete puudumist, on nende järelduste enesekindlaks tegemiseks vaja täiendavaid uuringuid. Need tulemused näitavad siiski, et süsteemipõhine CSF-paneel võib suurendada meie võimet haiguse asümptomaatilises staadiumis inimesi tõhusalt stratifitseerida.
Üldiselt toetavad meie leiud mitmete bioloogiliste funktsioonide rolli AD patogeneesis. Düsreguleeritud energia metabolism sai aga kõigi meie viie kinnitatud märgistuspaneeli silmapaistvaks teemaks. Metaboolsed valgud, nagu hüpoksantiin-guaniinfosforibosüültransferaas 1 (HPRT1) ja laktaatdehüdrogenaas A (LDHA), on kõige tugevamalt valideeritud sünaptilised biomarkerid, mis näitab, et AD CSF-i suurenemine on väga reprodutseeritav sugu. Meie veresooned ja gliiapaneelid sisaldavad ka mitmeid markereid, mis osalevad oksüdatiivsete ainete metabolismis. Need leiud on kooskõlas võtmerolliga, mida metaboolsed protsessid mängivad kogu ajus, mitte ainult neuronite suure energiavajaduse rahuldamiseks, vaid ka astrotsüütide ja teiste gliiarakkude suure energiavajaduse rahuldamiseks (17, 48). Meie tulemused toetavad kasvavaid tõendeid selle kohta, et muutused redokspotentsiaalis ja energiaradade katkemine võivad olla põhilüliks mitmete AD patogeneesis osalevate protsesside vahel, sealhulgas mitokondriaalsed häired, gliia vahendatud põletik ja veresoonte kahjustused (49). Lisaks sisaldavad metaboolsed tserebrospinaalvedeliku biomarkerid meie kontroll- ja AD-sarnaste AsymAD alarühmade vahel suurt hulka erinevalt rikkaid valke, mis viitab sellele, et nende energia- ja redoksradade katkemine võib olla haiguse prekliinilises staadiumis kriitiline.
Erinevatel aju- ja tserebrospinaalvedeliku paneelide suundumustel, mida oleme täheldanud, on ka huvitav bioloogiline mõju. Neuronite rikkad sünapsid ja metaboloomid näitavad AD ajus vähenenud taset ja suurenenud arvukust tserebrospinaalvedelikus. Arvestades, et neuronid on sünapsides rikkad energiat tootvate mitokondrite poolest, et anda energiat nende arvukate spetsiifiliste signaalide jaoks (50), eeldatakse nende kahe neuronirühma ekspressiooniprofiilide sarnasust. Neuronite kadu ja kahjustatud rakkude väljapressimine võib seletada neid aju- ja CSF-paneelide suundumusi hilisemates haigustes, kuid need ei saa seletada varajasi paneeli muutusi, mida me täheldame (13). Üks võimalik selgitus nende leidude kohta varajases asümptomaatilises haiguses on ebanormaalne sünaptiline pügamine. Uued tõendid hiiremudelite kohta viitavad sellele, et mikrogliia poolt vahendatud sünaptiline fagotsütoos võib AD korral ebanormaalselt aktiveeruda ja põhjustada ajus varajase sünapsi kadu (51). See äravisatud sünaptiline materjal võib akumuleeruda CSF-is, mistõttu jälgime neuronite paneelis CSF-i suurenemist. Immuunsüsteemi vahendatud sünaptiline pügamine võib osaliselt seletada ka gliaalvalkude suurenemist, mida täheldame ajus ja tserebrospinaalvedelikus kogu haigusprotsessi vältel. Lisaks sünaptilisele pügamisele võivad eksotsüütilise raja üldised kõrvalekalded põhjustada ka neuronaalsete markerite aju ja CSF-i erinevaid ekspressioone. Mitmed uuringud on näidanud, et eksosoomide sisaldus AD aju patogeneesis on muutunud (52). Ekstratsellulaarne rada on samuti seotud Aβ proliferatsiooniga (53, 54). Väärib märkimist, et eksosomaalse sekretsiooni pärssimine võib vähendada AD-sarnast patoloogiat AD transgeensetes hiiremudelites (55).
Samal ajal näitas veresoonte paneeli valk mõõdukat AD aju suurenemist, kuid vähenes oluliselt CSF-is. Hematoentsefaalbarjääri (BBB) düsfunktsioon võib neid leide osaliselt selgitada. Paljud sõltumatud surmajärgsed inimuuringud on näidanud BBB lagunemist AD korral (56, 57). Need uuringud kinnitasid mitmesuguseid ebanormaalseid tegevusi, mis ümbritsevad seda tihedalt suletud endoteelirakkude kihti, sealhulgas aju kapillaaride lekkimist ja vere kaudu levivate valkude perivaskulaarset akumuleerumist (57). See võib anda lihtsa seletuse aju suurenenud veresoonte valkude kohta, kuid see ei saa täielikult selgitada nende samade valkude ammendumist tserebrospinaalvedelikus. Üks võimalus on see, et kesknärvisüsteem isoleerib neid molekule aktiivselt, et lahendada suurenenud põletiku ja oksüdatiivse stressi probleem. Mõnede selle paneeli kõige raskemate CSF-valkude, eriti lipoproteiinide reguleerimisega seotud valkude vähenemine on seotud kahjulike põletikutasemete ja reaktiivsete hapnikuliikide neuroprotektiivse protsessi pärssimisega. See kehtib paroksonaasi 1 (PON1) kohta, lipoproteiine siduva ensüümi kohta, mis vastutab oksüdatiivse stressi taseme vähendamise eest vereringes (58, 59). Alfa-1-mikroglobuliini / bikuniini prekursor (AMBP) on teine vaskulaarse rühma oluliselt alla reguleeritud marker. See on lipiidide transporteri bikuniini eelkäija, mis osaleb ka põletiku supressioonis ja neuroloogilises kaitses (60, 61).
Vaatamata erinevatele huvitavatele hüpoteesidele on suutmatus otseselt tuvastada biokeemiliste haiguste mehhanisme avastuspõhise proteoomika analüüsi üldtuntud piirang. Seetõttu on nende biomarkerite paneelide taga olevate mehhanismide enesekindlaks määratlemiseks vaja täiendavaid uuringuid. SM-põhise kliinilise analüüsi arendamise poole liikumiseks eeldab tulevikusuund ka sihipäraste kvantitatiivsete meetodite kasutamist suuremahuliseks biomarkerite verifitseerimiseks, nagu selektiivne või paralleelne reaktsioonide monitooring (62). Hiljuti kasutasime paralleelset reaktsiooni jälgimist (63), et kinnitada paljusid siin kirjeldatud CSF-valgu muutusi. Mitmed prioriteetsed paneeli sihtmärgid on kvantifitseeritud olulise täpsusega, sealhulgas YWHAZ, ALDOA ja SMOC1, mis vastavad vastavalt meie sünapsi-, ainevahetus- ja põletikupaneelidele (63). Sõltumatu andmehõive (DIA) ja muud MS-põhised strateegiad võivad samuti olla kasulikud sihtmärgi kontrollimiseks. Bud et al. (64) Hiljuti näidati, et meie CSF-i avastamise andmekogumis tuvastatud AD biomarkerite ja sõltumatu DIA-MS-andmekogumi vahel, mis koosneb peaaegu 200 CSF-proovist kolmest erinevast Euroopa kohordist, on märkimisväärne kattumine. Need hiljutised uuringud toetavad meie paneelide potentsiaali muutuda usaldusväärseks MS-põhiseks tuvastamiseks. Traditsiooniline antikeha- ja aptameeripõhine tuvastamine on samuti oluline peamiste AD biomarkerite edasiarendamiseks. CSF-i vähese arvukuse tõttu on neid biomarkereid raskem tuvastada suure läbilaskevõimega MS-meetoditega. NEFL ja NRGN on kaks sellist näidet vähese arvukusega CSF biomarkeritest, mis on meie põhjaliku analüüsi käigus kaardistatud paneeliga, kuid mida ei saa meie ühe MS strateegia abil usaldusväärselt tuvastada. Mitmel antikehal, näiteks PEA-l, põhinevad sihtimisstrateegiad võivad soodustada nende markerite kliinilist transformatsiooni.
Üldiselt pakub see uuring ainulaadse proteoomika lähenemisviisi erinevatel süsteemidel põhinevate CSF AD biomarkerite tuvastamiseks ja kontrollimiseks. Nende markerite paneelide optimeerimine täiendavate AD-rühmade ja MS-platvormide vahel võib osutuda paljulubavaks AD-riski kihistumise ja ravi edendamiseks. Uuringud, mis hindavad nende paneelide pikisuunalist taset aja jooksul, on samuti olulised, et teha kindlaks, milline markerite kombinatsioon stratifitseerib kõige paremini varajase haiguse riski ja haiguse tõsiduse muutusi.
Kõik selles uuringus kasutatud CSF-i proovid, välja arvatud kolm CSF-i kopeeritud proovi, koguti Emory ADRC või sellega tihedalt seotud uurimisasutuste egiidi all. Nendes proteoomikauuringutes kasutati kokku nelja Emory CSF proovide komplekti. Leiti, et CSF-i kohort sisaldas proove 20 tervelt kontrollilt ja 20 AD-ga patsiendilt. CSF-i koopia 1 sisaldab proove 32 tervelt kontrollilt, 31 AsymAD-i isikult ja 33-lt AD-iga isikult. CSF-i koopia 2 sisaldab 147 kontrolli ja 150 AD proovi. Mitmehaiguse CSF replikatsiooni 4 kohort sisaldas 18 kontrolli, 17 AD, 19 ALS, 13 PD ja 11 FTD proovi. Vastavalt Emory ülikooli institutsionaalse ülevaatenõukogu poolt heaks kiidetud kokkuleppele said kõik Emory uuringus osalejad teadliku nõusoleku. Vastavalt 2014. aasta riikliku vananemisinstituudi parimate tavade juhistele Alzheimeri keskuste jaoks (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) koguti ja säilitati tserebrospinaalvedelik lumbaalpunktsiooniga. Kontroll- ja AsymAD- ja AD-patsiendid said standardiseeritud kognitiivse hinnangu Emory kognitiivse neuroloogia kliinikus või Goizueta ADRC-s. Nende tserebrospinaalvedeliku proove testiti INNO-BIA AlzBio3 Luminexiga ELISA Aβ1-42, kogu tau ja p-tau analüüsi jaoks (65). ELISA väärtusi kasutatakse katsealuste diagnostilise klassifitseerimise toetamiseks kehtestatud AD biomarkeri piirkriteeriumide alusel (66, 67). Teiste CSF-diagnooside (FTD, ALS ja PD) demograafilised ja diagnostilised põhiandmed saadakse ka Emory ADRC-lt või sellega seotud uurimisasutustelt. Nende Emory CSF-i juhtumite kokkuvõtlikud metaandmed leiate tabelist S1A. Šveitsi CSF replikatsiooni 3 kohordi omadused on varem avaldatud (45).
CSF leidis proovi. CSF-i andmekogumi avastamise sügavuse suurendamiseks viidi enne trüpsiniseerimist läbi suure hulga valkude immuuntarbimine. Lühidalt, 130 μl CSF 40 individuaalsest CSF proovist ja võrdne maht (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) asetati ruumis olevasse tsentrifuugimiskolonni (Thermo Fisher Scientific, A89868). temperatuur Inkubeeri). Pärast 15-minutilist tsentrifuugimist tsentrifuugige proovi 1000 g juures 2 minutit. Heitveeproovi kontsentreerimiseks kasutati 3K ultratsentrifugaalfiltri seadet (Millipore, UFC500396), tsentrifuugides 14 000 g juures 30 minutit. Kõik proovimahud lahjendatakse fosfaatpuhverdatud soolalahusega 75 μl-ni. Valgu kontsentratsiooni hinnati bicinchoninic acid (BCA) meetodil vastavalt tootja protokollile (Thermo Fisher Scientific). Kõigist 40 proovist saadud immuunpuudulikkusega CSF (60 μl) seediti lüsüülendopeptidaasi (LysC) ja trüpsiiniga. Lühidalt öeldes proov redutseeriti ja alküüliti 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksüetüül)-fosfiini ja 3 μl 0,8 M kloroatsetamiidiga temperatuuril 90 °C 10 minutit ning seejärel töödeldi ultraheliga veevannis 15 minutit. Proov lahjendati 193 μl 8 M uurea puhvriga [8 M uurea ja 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] lõppkontsentratsioonini 6 M karbamiidi. LysC (4,5 μg; Wako) kasutatakse üleöö seedimiseks toatemperatuuril. Seejärel lahjendati proov 1 M uureaks 50 mM ammooniumvesinikkarbonaadiga (ABC) (68). Lisage võrdne kogus (4,5 μg) trüpsiini (Promega) ja inkubeerige proovi 12 tundi. Hapestada lagundatud peptiidi lahus lõppkontsentratsioonini 1% sipelghapet (FA) ja 0,1% trifluoroäädikhapet (TFA) (66) ning seejärel soolatustada 50 mg Sep-Pak C18 kolonniga (Waters), nagu eespool kirjeldatud (25). . Seejärel elueeriti peptiid 1 ml 50% atsetonitriilis (ACN). Valkude kvantifitseerimise standardiseerimiseks partiide lõikes (25) ühendati kõigist 40 CSF-i proovist 100 μl alikvoodid, et saada segaproov, mis seejärel jagati viieks globaalse sisestandardi (GIS) (48) prooviks. Kõik üksikproovid ja kombineeritud standardid kuivatatakse kiirvaakumiga (Labconco).
CSF kopeerib proovi. Dayon ja tema kolleegid on varem kirjeldanud immuunsüsteemi ammendumist ja CSF-i koopia 3 proovide seedimist (45, 46). Ülejäänud kordusproovid ei olnud individuaalselt ammendatud. Seedige need eemaldamata proovid trüpsiinis, nagu eelnevalt kirjeldatud (17). Iga korduva analüüsi jaoks liideti igast proovist elueeritud peptiidi 120 μl alikvoodid kokku ja jagati võrdseteks alikvootideks, et kasutada neid TMT-märgisega globaalse sisestandardina (48). Kõik üksikproovid ja kombineeritud standardid kuivatatakse kiirvaakumiga (Labconco). Vähese CSF-valgu signaali suurendamiseks, kombineerides igast proovist 125 μl, valmistati iga kordusanalüüsi jaoks ette täiustatud proov [st bioloogiline proov, mis jäljendab uuritavat proovi, kuid saadaolev kogus on palju suurem (37, 69)] liideti CSF segaprooviks (17). Seejärel eemaldati segatud proov immunoreemaldati, kasutades 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resini (Thermo Fisher Scientific, A36372), seediti ülalkirjeldatud viisil ja lisati järgnevasse mitmekordsesse TMT-märgisesse.
Postitusaeg: 27. august 2021