Täname, et külastasite veebilehte Nature.com. Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Termofiilid on mikroorganismid, mis arenevad kõrgel temperatuuril. Nende uurimine võib anda väärtuslikku teavet selle kohta, kuidas elu kohaneb äärmuslike tingimustega. Siiski on tavapäraste optiliste mikroskoopidega raske saavutada kõrge temperatuuri tingimusi. Välja on pakutud mitmeid koduseid lahendusi, mis põhinevad lokaalsel takistuselektriküttel, kuid lihtsat kommertslahendust pole. Selles artiklis tutvustame mikroskoobi vaatevälja mikroskaala laserkuumutamise kontseptsiooni, et tagada termofiilsete uuringute jaoks kõrge temperatuur, hoides samal ajal kasutaja keskkonna pehmena. Mõõduka laserintensiivsusega mikroskaala kuumutamist saab saavutada, kasutades bioloogiliselt ühilduva ja tõhusa valguse neeldujana kulla nanoosakestega kaetud substraati. Arutatakse mikroskaala vedeliku konvektsiooni, rakkude peetuse ja tsentrifugaalse termoforeetilise liikumise võimalikke mõjusid. Meetodit on demonstreeritud kahe liigi puhul: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktiivne termofiilne bakter, mis paljuneb umbes 65 °C juures ja mille idanemist, kasvu ja ujumist oleme täheldanud mikroskaala kuumutamisel; (ii) Thiobacillus sp., optimaalselt hüpertermofiilne arhea. 80°C juures. See töö sillutab teed termofiilsete mikroorganismide lihtsaks ja ohutuks vaatlemiseks kaasaegsete ja taskukohaste mikroskoopiavahendite abil.
Miljardite aastate jooksul on elu Maal arenenud, et kohaneda paljude keskkonnatingimustega, mida mõnikord peetakse meie inimeste vaatenurgast äärmuslikeks. Eelkõige arenevad mõned termofiilsed mikroorganismid (bakterid, arheed, seened), mida nimetatakse termofiilideks, temperatuurivahemikus 45°C kuni 122°C1, 2, 3, 4. Termofiilid elavad erinevates ökosüsteemides, näiteks süvamere hüdrotermilistes tuulutusavades, kuumaveeallikates. või vulkaanilised alad. Nende uurimistöö on viimastel aastakümnetel tekitanud palju huvi vähemalt kahel põhjusel. Esiteks saame neilt õppida näiteks seda, kuidas termofiilid 5, 6, ensüümid 7, 8 ja membraanid 9 on nii kõrgetel temperatuuridel stabiilsed või kuidas termofiilid taluvad äärmuslikku kiirgust10. Teiseks on need aluseks paljudele olulistele biotehnoloogilistele rakendustele1,11,12, nagu kütuse tootmine13,14,15,16, keemiline süntees (dihüdro, alkoholid, metaan, aminohapped jne)17, biokaevandamine18 ja termostabiilsed biokatalüsaatorid7,11, 13. Eelkõige hõlmab praegu hästi tuntud polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)19 ensüümi (Taq polümeraas), mis on eraldatud termofiilsest bakterist Thermus aquaticus, mis on üks esimesi avastatud termofiile.
Termofiilide uurimine pole aga kerge ülesanne ja seda ei saa üheski bioloogilises laboris improviseerida. Eelkõige ei saa elavaid termofiile in vitro jälgida ühegi standardse valgusmikroskoobiga, isegi mitte kaubanduslikult saadavate kuumutuskambritega, mille temperatuur on tavaliselt nii madal kui 40 °C. Alates 1990. aastatest on vaid vähesed uurimisrühmad pühendunud kõrgtemperatuuriliste mikroskoopiasüsteemide (HTM) kasutuselevõtule. Aastal 1994 Glukh et al. Kütte-/jahutuskamber töötati välja Peltier elemendi kasutamise põhjal, mis kontrollib suletud ristkülikukujuliste kapillaaride temperatuuri, et säilitada anaeroobsus 20 . Seadet saab kuumutada kuni 100 °C-ni kiirusega 2 °C/s, mis võimaldab autoritel uurida hüpertermofiilse bakteri Thermotoga maritima21 motoorikat. Aastal 1999 Horn et al. Välja on töötatud väga sarnane seade, mis põhineb endiselt kaubanduslikuks mikroskoopiaks sobivate kuumutatud kapillaaride kasutamisel rakkude jagunemise/ühendamise uurimiseks. Pärast pikka suhtelist passiivsust jätkati 2012. aastal tõhusate HTM-ide otsimist, eriti seoses Wirthi rühma dokumentidega, milles kasutati Horni jt leiutatud seadet. Viisteist aastat tagasi uuriti kuumutatud kapillaare kasutades kuni 100°C temperatuuridel kuni 100°C suure hulga arheide, sealhulgas hüpertermofiilide liikuvust23,24. Samuti muutsid nad algset mikroskoopi, et saavutada kiirem kuumutamine (määratud temperatuuri saavutamiseks kulub 35 minuti asemel mitu minutit) ja saavutada lineaarne temperatuurigradient üle 2 cm. Seda temperatuurigradiendi kujundamise seadet (TGFD) on kasutatud paljude termofiilide liikuvuse uurimiseks temperatuurigradientide piires bioloogiliselt olulistel vahemaadel 24, 25 .
Suletud kapillaaride soojendamine pole ainus viis elusate termofiilide vaatlemiseks. 2012. aastal tegid Kuwabara jt. Kasutati omatehtud ühekordselt kasutatavaid Pyrexi kambreid, mis olid suletud kuumakindla liimiga (Super X2; Cemedine, Jaapan). Proovid asetati kaubanduslikult saadavale läbipaistvale kuumutusplaadile (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Jaapan), mis oli võimeline kuumutama temperatuurini 110 °C, kuid ei olnud algselt ette nähtud biopildistamiseks. Autorid täheldasid anaeroobsete termofiilsete bakterite (Thermosipho globiformans, kahekordistumisaeg 24 minutit) tõhusat jagunemist 65 °C juures. 2020. aastal tegid Pulshen jt. Kaubanduslike metallnõude (AttofluorTM, Thermofisher) tõhusat kuumutamist demonstreeriti kahe omatehtud kuumutuselemendiga: kaas ja lava (PCR-masinast inspireeritud konfiguratsioon). Selle koosluse tulemuseks on ühtlane vedeliku temperatuur ning see hoiab ära aurustumise ja kondenseerumise kaane põhjas. O-rõnga kasutamine väldib gaasivahetust keskkonnaga. Seda HTM-i, mida nimetatakse sulfoskoobiks, kasutati Sulfolobus acidocaldariuse pildistamiseks temperatuuril 75 °C27.
Kõigi nende süsteemide tunnustatud piirang oli õhuobjektiivide kasutamise piirang, kuna igasugune õlikümblus ei sobi nii kõrgele temperatuurile ega pildistamiseks läbi üle 1 mm paksuste läbipaistvate proovide. Kõigi nende süsteemide tunnustatud piirang oli õhuobjektiivide kasutamise piirang, kuna igasugune õlikümblus ei sobi nii kõrgele temperatuurile ega pildistamiseks läbi üle 1 mm paksuste läbipaistvate proovide. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективсков, погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачны через прозрачны Kõigi nende süsteemide tunnistatud puuduseks oli õhuobjektiivide kasutamise piiratus, kuna igasugune õlikümblus ei sobinud nii kõrgele temperatuurile ega visualiseerimiseks läbipaistvate > 1 mm paksuste proovide kaudu.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适叹浸都不适吂嚿毫米厚的透明样品成像. Kõigi nende süsteemide tunnustatud piirang on õhuga peegli kasutamise piirang, kuna õlikümblus ei sobi üle 1 mm paksuste läbipaistvate proovide pildistamiseks nii kõrgetel temperatuuridel. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушорных обюбовектиморных объвектиморных ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозмрачные образцы нол1щицы нол1щих температур и визуализации через прозмрачные образцы. Kõigi nende süsteemide tunnustatud puuduseks on õhkläätsede piiratud kasutamine, igasugune õlikümblus ei sobi nii kõrgetele temperatuuridele ja visualiseerimine läbi läbipaistvate proovide, mille paksus on >1 mm.Hiljuti tühistasid selle piirangu Charles-Orzag jt. 28, kes töötas välja seadme, mis ei anna soojust enam huvipakkuva süsteemi ümber, vaid pigem katteklaasi enda sees, mis on kaetud õhukese läbipaistva ITO-st (indium-tina oksiid) valmistatud takisti kihiga. Kaant saab kuumutada temperatuurini 75 °C, juhtides läbi läbipaistva kihi elektrivoolu. Siiski peab autor objektiivi ka objektiivini soojendama, kuid mitte üle 65 °C, et seda mitte kahjustada.
Need tööd näitavad, et tõhusa kõrgtemperatuurse optilise mikroskoopia väljatöötamist ei ole laialdaselt kasutusele võetud, see nõuab sageli omatehtud seadmeid ja see saavutatakse sageli ruumilise eraldusvõime hinnaga, mis on tõsine puudus, arvestades, et termofiilsed mikroorganismid ei ole suuremad kui paar. mikromeetrid. Vähendatud kuumutamismaht on HTM-i kolme omase probleemi lahendamise võti: halb ruumiline eraldusvõime, kõrge termiline inerts süsteemi kuumenemisel ja ümbritsevate elementide (immersioonõli, objektiivi läätsed või kasutaja käed) kahjulik kuumenemine äärmuslikel temperatuuridel. ).
Selles artiklis tutvustame termofiilse vaatluse HTM-i, mis ei põhine takistuslikul kuumutamisel. Selle asemel saavutasime lokaliseeritud kuumutamise mikroskoobi vaatevälja piiratud piirkonnas valgust neelava substraadi laserkiirgusega. Temperatuurijaotus visualiseeriti kvantitatiivse faasimikroskoopia (QPM) abil. Selle meetodi tõhusust demonstreerivad Geobacillus stearothermophilus, liikuv termofiilne bakter, mis paljuneb umbes 65 °C juures ja millel on lühike kahekordistumisaeg (umbes 20 minutit), ja Sulfolobus shibatae, hüpertermofiil, mis kasvab optimaalselt 80 °C juures (arhaea). illustreerima. Temperatuuri funktsioonina täheldati normaalset replikatsioonikiirust ja ujumist. Seda laser-HTM-i (LA-HTM) ei piira katteklaasi paksus ega objektiivi olemus (õhk- või õliimmersioon). See võimaldab kasutada kõiki turul olevaid kõrge eraldusvõimega objektiive. Samuti ei kannata see termilise inertsi tõttu aeglast kuumenemist (saavutab kohese kuumutamise millisekundi skaalal) ja kasutab ainult kaubanduslikult saadavaid komponente. Ainsad uued ohutusprobleemid on seotud võimsate laserkiirte (tavaliselt kuni 100 mW) olemasoluga seadme sees ja võib-olla ka läbi silmade, mis nõuavad kaitseprille.
LA-HTM-i põhimõte on kasutada laserit proovi lokaalseks kuumutamiseks mikroskoobi vaateväljas (joonis 1a). Selleks peab proov olema valgust neelav. Mõistliku laservõimsuse (alla 100 mW) kasutamiseks ei tuginenud me vedela keskkonna valguse neeldumisele, vaid suurendasime kunstlikult proovi neeldumist, kattes substraadi kulla nanoosakestega (joonis 1c). Kulla nanoosakeste kuumutamine valgusega on termilise plasmoonika valdkonnas ülioluline, eeldatavalt kasutatakse neid biomeditsiinis, nanokeemias või päikesevalguse kogumisel 29, 30, 31. Viimastel aastatel oleme seda LA-HTM-i kasutanud mitmetes uuringutes, mis on seotud termoplasma rakendustega füüsikas, keemias ja bioloogias. Selle meetodi peamiseks raskuseks on lõpliku temperatuuriprofiili kuvamine, kuna kõrgendatud temperatuur on piiratud proovi mikroskaala piirkonnaga. Oleme näidanud, et temperatuuri kaardistamist saab saavutada nelja lainepikkuse põiksuunalise nihkeinterferomeetriga, mis on lihtne, kõrge eraldusvõimega ja väga tundlik kvantitatiivse faasimikroskoopia meetod, mis põhineb kahemõõtmeliste difraktsioonivõrede (tuntud ka kui ristvõre) kasutamisel. 33,34,35,36. Selle ristvõre lainefrondi mikroskoopial (CGM) põhineva termilise mikroskoopia tehnika usaldusväärsust on demonstreeritud kümnes viimase kümnendi jooksul avaldatud artiklis 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.
Paralleelse lasersoojendus-, vormimis- ja temperatuurimikroskoobi paigaldusskeem. b Proovigeomeetria, mis koosneb AttofluorTM kambrist, mis sisaldab kulla nanoosakestega kaetud katteklaasi. c Vaadake näidist tähelepanelikult (mitte mõõtkavas). d tähistab ühtlast laserkiire profiili ja (e) simuleeritud järgnevat temperatuurijaotust kulla nanoosakeste proovitasandil. f on rõngakujuline laserkiire profiil, mis sobib ühtlase temperatuuri genereerimiseks, nagu on näidatud punktis (g) näidatud temperatuurijaotuse simulatsioonis. Skaalariba: 30 µm.
Eelkõige saavutasime hiljuti imetajarakkude kuumutamise LA-HTM-i ja CGM-iga ning jälgisime rakkude kuumašoki reaktsioone vahemikus 37–42 °C, mis näitab selle tehnika rakendatavust üksikute elusrakkude pildistamisel. LA-HTM-i rakendamine mikroorganismide uurimisel kõrgetel temperatuuridel ei ole aga üheselt mõistetav, kuna nõuab imetajarakkudega võrreldes suuremat ettevaatust: esiteks viib söötme põhja kuumutamine kümnete kraadide (mitte mõne kraadi) võrra. tugevale vertikaalsele temperatuurigradientile. võib tekitada vedeliku konvektsiooni 44, mis, kui see ei ole aluspinnaga kindlalt kinni, võib põhjustada soovimatut liikumist ja bakterite segunemist. Seda konvektsiooni saab kõrvaldada, vähendades vedelikukihi paksust. Sel eesmärgil asetati kõigis allpool esitatud katsetes bakterisuspensioonid kahe ligikaudu 15 µm paksuse katteklaasi vahele, mis asetati metalltopsi sisse (AttofluorTM, Thermofisher, joonised 1b, c). Põhimõtteliselt saab konvektsiooni vältida, kui vedeliku paksus on väiksem kui kuumutuslaseri kiire suurus. Teiseks võib sellise piiratud geomeetriaga töötamine aeroobsed organismid lämmatada (vt joonis S2). Seda probleemi saab vältida, kasutades hapnikku (või mõnda muud elutähtsat gaasi) läbilaskvat substraati, jättes katteklaasi sisse kinni jäänud õhumullid või puurides ülemisse katteklaasi augud (vt joonis S1) 45 . Selles uuringus valisime viimase lahenduse (joonised 1b ja S1). Lõpuks ei taga laserkuumutamine ühtlast temperatuurijaotust. Isegi laserkiire sama intensiivsuse korral (joonis 1d) ei ole temperatuurijaotus ühtlane, vaid pigem meenutab termilise difusiooni tõttu Gaussi jaotust (joonis 1e). Kui eesmärk on määrata bioloogiliste süsteemide uurimiseks vaateväljas täpsed temperatuurid, ei ole ebaühtlased profiilid ideaalsed ja võivad põhjustada ka bakterite termoforeetilist liikumist, kui nad ei kleepu substraadile (vt joonis S3, S4)39. Selleks kasutasime ruumilise valguse modulaatorit (SLM), et kujundada infrapuna laserkiir vastavalt rõnga kujule (joonis 1f) proovi tasapinnas, et saavutada täiesti ühtlane temperatuurijaotus antud geomeetrilises piirkonnas. vaatamata termilisele difusioonile (joonis 1d) 39 , 42, 46. Asetage ülemine katteklaas metallnõu peale (joonis 1b), et vältida söötme aurustumist, ja jälgige seda vähemalt paar päeva. Kuna see ülemine katteklaas ei ole suletud, saab vajaduse korral igal ajal hõlpsasti lisada lisakandjat.
Et illustreerida LA-HTM-i toimimist ja demonstreerida selle rakendatavust termofiilsetes uuringutes, uurisime aeroobseid baktereid Geobacillus stearothermophilus, mille optimaalne kasvutemperatuur on umbes 60–65 °C. Bakteril on ka lipukesed ja võime ujuda, mis annab järjekordse raku normaalse aktiivsuse näitaja.
Proove (joonis 1b) eelinkubeeriti 60 °C juures üks tund ja asetati seejärel LA-HTM proovihoidikusse. See eelinkubatsioon on valikuline, kuid siiski kasulik kahel põhjusel: esiteks, kui laser on sisse lülitatud, põhjustab see rakkude kohest kasvu ja jagunemist (vt filmi M1 lisamaterjalidest). Ilma eelinkubatsioonita viibib bakterite kasv tavaliselt umbes 40 minutit iga kord, kui proovile uut vaateala kuumutatakse. Teiseks soodustas 1-tunnine eelinkubatsioon bakterite adhesiooni katteklaasile, vältides rakkude termoforeesi tõttu vaateväljast välja triivimist, kui laser oli sisse lülitatud (vt filmi M2 lisamaterjalides). Termoforees on osakeste või molekulide liikumine mööda temperatuurigradienti, tavaliselt kuumast külmani, ning bakterid pole erandiks43,47. See soovimatu mõju kõrvaldatakse antud alal, kasutades SLM-i laserkiire kujundamiseks ja ühtlase temperatuurijaotuse saavutamiseks.
Joonisel fig. Joonisel 2 on kujutatud CGM-ga mõõdetud temperatuurijaotus, mis saadakse kulla nanoosakestega kaetud klaassubstraadi kiiritamisel rõngakujulise laserkiirega (joonis 1f). Täheldati tasast temperatuurijaotust kogu laserkiirega kaetud alal. See tsoon määrati optimaalseks kasvutemperatuuriks 65 °C. Väljaspool seda piirkonda langeb temperatuurikõver loomulikult väärtusele \(1/r\) (kus \(r\) on radiaalkoordinaat).
CGM mõõtmiste temperatuurikaart, mis on saadud rõngakujulise laserkiire abil kulla nanoosakeste kihi kiiritamiseks, et saada ümmargusel alal tasane temperatuuriprofiil. b Temperatuurikaardi isoterm (a). Laserkiire kontuur on kujutatud halli punktiirjoonega. Katset korrati kaks korda (vt lisamaterjalid, joonis S4).
Bakterirakkude elujõulisust jälgiti mitu tundi, kasutades LA-HTM-i. Joonisel fig. 3 näitab ajavahemikku nelja pildi jaoks, mis on tehtud 3 tundi ja 20 minutit kestvast filmist (Movie M3, lisateave). Täheldati, et bakterid vohasid aktiivselt laseriga määratletud ringikujulises piirkonnas, kus temperatuur oli optimaalne, lähenedes 65 °C-le. Seevastu rakkude kasv vähenes oluliselt, kui temperatuur langes 10 sekundi jooksul alla 50 ° C.
Optilised sügavuspildid G. stearothermophilus bakteritest, mis kasvavad pärast laserkuumutamist erinevatel aegadel, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, out of 200 Ekstraheeritud üheminutilisest filmist (M3-kile, mis on esitatud täiendavas teabes), mis on asetatud vastavale temperatuurikaardile. Laser lülitub sisse ajal \(t=0\). Intensiivsusega pildile on lisatud isotermid.
Rakkude kasvu ja selle sõltuvuse temperatuurist täiendavaks kvantifitseerimiseks mõõtsime Movie M3 vaateväljas algselt eraldatud bakterite erinevate kolooniate biomassi suurenemist (joonis 4). Minikolooniaid moodustava üksuse (mCFU) moodustumise alguses valitud vanembakterid on näidatud joonisel S6. Kuivmassi mõõtmised tehti CGM 48 kaameraga, mida kasutati temperatuurijaotuse kaardistamiseks. CGM-i võime mõõta kuivmassi ja temperatuuri on LA-HTM-i tugevus. Ootuspäraselt põhjustas kõrge temperatuur bakterite kiirema kasvu (joonis 4a). Nagu on näidatud joonisel 4b poollogaritmilisel graafikul, järgib kasv kõigil temperatuuridel eksponentsiaalset kasvu, kus andmed kasutavad eksponentsiaalset funktsiooni \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kus \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}2\) – genereerimise aeg (või kahekordistamise aeg), \( g =1/ \tau\) – kasvutempo (jagamiste arv ajaühikus ). Joonisel fig. 4c näitab vastavat kasvukiirust ja genereerimisaega temperatuuri funktsioonina. Kiiresti kasvavaid mCFU-sid iseloomustab kasvu küllastumine kahe tunni pärast, mis on eeldatav käitumine kõrge bakteritiheduse tõttu (sarnaselt klassikaliste vedelkultuuride statsionaarsele faasile). Üldkuju \(g\left(T\right)\) (joonis 4c) vastab G. stearothermophilus'e eeldatavale kahefaasilisele kõverale optimaalse kasvukiirusega umbes 60–65 °C. Sobitage andmed kardinaalse mudeli abil (joonis S5)49, kus \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, mis sobib hästi kokku teiste kirjanduses viidatud väärtustega49. Kuigi temperatuurist sõltuvad parameetrid on reprodutseeritavad, võib \({G}_{0}\) maksimaalne kasvukiirus erinevates katsetes erineda (vt jooniseid S7-S9 ja filmi M4). Erinevalt temperatuuri sobitamise parameetritest, mis peaksid olema universaalsed, sõltub maksimaalne kasvukiirus söötme omadustest (toitainete saadavus, hapniku kontsentratsioon) vaadeldava mikroskaala geomeetria piires.
a Mikroobide kasv erinevatel temperatuuridel. mCFU: miniatuursed kolooniaid moodustavad üksused. Andmed on saadud videost ühest temperatuurigradiendis kasvavast bakterist (film M3). b Sama mis (a), poollogaritmiline skaala. c Lineaarse regressiooni (b) põhjal arvutatud kasvukiirus\(\tau\) ja genereerimisaeg\(g\). Horisontaalsed vearibad: temperatuurivahemik, mille üle mCFU-d kasvu ajal vaatevälja laienesid. Vertikaalsed vearibad: lineaarse regressiooni standardviga.
Lisaks normaalsele kasvule hõljusid mõned bakterid mõnikord laserkuumutamise ajal nähtavale, mis on flagellaga bakterite puhul eeldatav käitumine. Lisainfos olev film M5 näitab selliseid ujumistegevusi. Selles katses kasutati temperatuurigradiendi loomiseks ühtlast laserkiirgust, nagu on näidatud joonistel 1d, e ja S3. Joonisel 5 on näidatud kaks M5 filmist valitud pildijada, mis näitavad, et ühel bakteril on suunatud liikumine, samas kui kõik teised bakterid jäävad liikumatuks.
Kaks ajaraami (a) ja (b) näitavad kahe erineva bakteri ujumist, mis on tähistatud punktiirringidega. Pildid eraldati filmist M5 (esitatud lisamaterjalina).
G. stearothermophilus'e puhul algas bakterite aktiivne liikumine (joonis 5) mõni sekund pärast laserkiire sisselülitamist. See tähelepanek rõhutab selle termofiilse mikroorganismi ajalist reaktsiooni temperatuuri tõusule, nagu on juba täheldanud Mora et al. 24 . Bakterite liikuvuse ja isegi termotaksise teemat saab edasi uurida LA-HTM-i abil.
Mikroobide ujumist ei tohiks segi ajada muud tüüpi füüsilise liikumisega, nimelt (i) Browni liikumisega, mis näib olevat kaootiline liikumine, millel puudub kindel suund, (ii) konvektsioon 50 ja termoforees 43, mis seisnevad korrapärases liikumises mööda temperatuuri. gradient.
G. stearothermophilus on tuntud oma võime poolest toota väga vastupidavaid eoseid (eoste moodustumine), kui see puutub kokku ebasoodsate keskkonnatingimustega kaitseks. Kui keskkonnatingimused muutuvad taas soodsaks, idanevad eosed, moodustades elusrakke ja jätkates kasvu. Kuigi see sporulatsiooni/idanemise protsess on hästi teada, pole seda kunagi reaalajas täheldatud. Kasutades LA-HTM-i, esitame siin esimese vaatluse G. stearothermophilus'e idanemise kohta.
Joonisel fig. 6a näitab optilise sügavuse (OT) aeglustatud pilte, mis on saadud 13 eosest koosneva CGM komplekti abil. Kogu kogumisaja jooksul (15 h 6 min, \(t=0\) – laserkuumutamise algus) idanes 13 eosest 4, järjestikustel ajahetkedel \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)" ja \(11\) h \(30\)". Kuigi joonisel 6 on näidatud ainult üks neist sündmustest, võib lisamaterjalis M6 filmis jälgida 4 idanemissündmust. Huvitaval kombel näib idanemine olevat juhuslik: kõik eosed ei idane ega idane samal ajal, hoolimata samadest muutustest keskkonnatingimustes.
a Time-lapse, mis koosneb 8 OT kujutisest (õliimmersioon, 60x, 1,25 NA objektiiv) ja (b) G. stearothermophilus agregaatide biomassi evolutsioon. c (b) Joonistatud poollogaritmilisel skaalal, et esile tõsta kasvukiiruse lineaarsust (katkendjoon).
Joonisel fig. 6b, c on kujutatud rakupopulatsioonide biomassi vaateväljas aja funktsioonina kogu andmete kogumise perioodi jooksul. Kuivmassi kiire lagunemine, mida täheldati \(t=5\)h juures joonisel fig. 6b, c, mõnede rakkude vaateväljast väljumise tõttu. Nende nelja sündmuse kasvutempo on \(0,77\pm 0,1\) h-1. See väärtus on suurem kui joonistel 3. 3 ja 4 seotud kasvukiirus, kus rakud kasvavad normaalselt. G. stearothermophilus'e eostest kasvukiiruse suurenemise põhjus on ebaselge, kuid need mõõtmised rõhutavad LA-HTM-i huvi ja töötavad üksiku raku tasemel (või üksiku mCFU tasemel), et saada rohkem teavet raku eluea dünaamika kohta. .
LA-HTM-i mitmekülgsuse ja kõrgetel temperatuuridel toimimise edasiseks demonstreerimiseks uurisime Sulfolobus shibatae, hüpertermofiilse atsidofiilse arhee kasvu optimaalse kasvutemperatuuriga 80 °C51. Võrreldes G. stearothermophilus'ega on need arheed ka väga erineva morfoloogiaga, meenutades pigem 1 mikroni suurusi kerakesi (kokke), mitte piklikke vardaid (batsillid).
Joonis 7a koosneb S. shibatae mCFU järjestikustest optilistest sügavuskujutistest, mis on saadud CGM-i abil (vt M7 mängufilmi lisamaterjalidest). See mCFU kasvab umbes 73 °C juures, alla optimaalse temperatuuri 80 °C, kuid aktiivse kasvu temperatuurivahemikus. Täheldasime mitmeid lõhustumise sündmusi, mis muutsid mCFU-d mõne tunni pärast välja nagu arhea mikroviinamarjad. Nendest OT-piltidest mõõdeti mCFU biomassi aja jooksul ja see esitati joonisel 7b. Huvitav on see, et S. shibatae mCFU-d näitasid pigem lineaarset kasvu kui eksponentsiaalset kasvu, mida täheldati G. stearothermophilus mCFU-de puhul. Rakkude kasvukiiruste olemuse üle on pikka aega arutatud 52: kui mõned uuringud näitavad mikroobide kasvumäärasid, mis on võrdelised nende suurusega (eksponentsiaalne kasv), siis teised näitavad konstantset kiirust (lineaarne või bilineaarne kasv). Nagu selgitasid Tzur et al.53, nõuab eksponentsiaalse ja (bi)lineaarse kasvu eristamiseks biomassi mõõtmise täpsust <6%, mis on enamiku QPM tehnikate jaoks kättesaamatu, isegi kui see hõlmab interferomeetriat. Nagu selgitasid Tzur et al.53, nõuab eksponentsiaalse ja (bi)lineaarse kasvu eristamiseks biomassi mõõtmise täpsust <6%, mis on enamiku QPM tehnikate jaoks kättesaamatu, isegi kui see hõlmab interferomeetriat. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точрености, точности <6% ижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Nagu selgitasid Zur et al.53, nõuab eksponentsiaalse ja (bi)lineaarse kasvu eristamine biomassi mõõtmisel <6% täpsust, mis pole enamiku QPM meetodite puhul saavutatav isegi interferomeetriat kasutades.Nagu selgitasid Zur et al. Nagu on näidatud joonisel 53, nõuab eksponentsiaalse ja (bi)lineaarse kasvu eristamine biomassi mõõtmisel vähem kui 6% täpsust, mis on enamiku QPM-meetodite puhul saavutamatu, isegi kui kasutatakse interferomeetriat. CGM saavutab selle täpsuse biomassi mõõtmisel alla pg täpsusega36,48.
ajavahemik, mis koosneb 6 OT-pildist (õliimmersioon, 60x, NA-objektiiv 1,25) ja (b) mikro-CFU biomassi evolutsioon, mõõdetuna CGM-iga. Lisateabe saamiseks vaadake filmi M7.
S. shibatae täiuslikult lineaarne kasv oli ootamatu ja sellest pole veel teatatud. Siiski on oodata eksponentsiaalset kasvu, vähemalt seetõttu, et aja jooksul peavad toimuma 2, 4, 8, 16 … raku mitmekordsed jagunemised. Me oletasime, et lineaarne kasv võib olla tingitud rakkude inhibeerimisest, mis on tingitud rakkude tihedast pakkimisest, nii nagu rakkude kasv aeglustub ja jõuab lõpuks puhkeolekusse, kui rakkude tihedus on liiga kõrge.
Lõpetuseks arutame järgemööda viit huvipakkuvat punkti: kuumutamismahu vähendamine, termilise inertsi vähendamine, huvi kulla nanoosakeste vastu, huvi kvantitatiivse faasimikroskoopia vastu ja võimalikku temperatuurivahemikku, milles LA-HTM-i saab kasutada.
Võrreldes takistusliku kuumutamisega pakub HTM-i arendamiseks kasutatav laserküte mitmeid eeliseid, mida selles uuringus illustreerime. Eelkõige hoitakse mikroskoobi vaateväljas vedelas keskkonnas kuumutamismahtu mõne (10 μm) 3 mahu piires. Sel viisil on aktiivsed ainult vaadeldud mikroobid, teised bakterid aga uinuvad ja neid saab kasutada proovi edasiseks uurimiseks – ei ole vaja proovi iga kord vahetada, kui on vaja uut temperatuuri kontrollida. Lisaks võimaldab mikroskaala kuumutamine otse uurida suurt temperatuurivahemikku: joonis 4c saadi 3-tunnisest filmist (Movie M3), mis nõuab tavaliselt mitme proovi ettevalmistamist ja uurimist – iga uuritava proovi kohta üks. y on temperatuur, mis tähistab katse päevade arvu. Kuumutatud ruumala vähendamine hoiab ka kõik mikroskoobi ümbritsevad optilised komponendid, eriti objektiivi, toatemperatuuril, mis on seni olnud kogukonna jaoks suur probleem. LA-HTM-i saab kasutada mis tahes objektiiviga, sealhulgas õlikümblusläätsedega, ja see püsib toatemperatuuril isegi äärmuslike temperatuuride korral vaateväljas. Selles uuringus kirjeldatud laserkuumutusmeetodi peamine piirang on see, et rakud, mis ei kleepu ega hõlju, võivad olla vaateväljast kaugel ja neid on raske uurida. Lahendus võib olla väikese suurendusega läätsede kasutamine, et saavutada suurem temperatuuri tõus, mis ületab mõnesaja mikroni. Selle ettevaatusega kaasneb ruumilise eraldusvõime vähenemine, kuid kui eesmärk on uurida mikroorganismide liikumist, ei ole kõrge ruumiline eraldusvõime vajalik.
Süsteemi soojendamise (ja jahutamise) ajaskaala \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) sõltub selle suurusest, vastavalt seadusele \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kus \ (L\ ) on soojusallika iseloomulik suurus (laserkiire läbimõõt meie uuringus on \(L\ umbes 100\) μm), \(D\) on keskkonna termiline difusioon (meie keskmine korpus, klaas ja vesi Difusioonikiirus\(D\ umbes 2\ korda {10}^{-7}\) m2/s). Temperatuuri tõusu hetkeline kehtestamine mitte ainult ei lühenda katse kestust, vaid võimaldab ka täpset ajastamist \ (t = 0 \) mis tahes temperatuuri mõjude dünaamilisteks uuringuteks.
Meie pakutud meetod on rakendatav mis tahes valgust neelavale substraadile (näiteks ITO-kattega kaubanduslikud proovid). Kulla nanoosakesed on aga võimelised tagama kõrge neeldumise infrapunas ja madala neeldumise nähtavas piirkonnas, mille viimased omadused pakuvad huvi tõhusaks optiliseks vaatluseks nähtavas piirkonnas, eriti fluorestsentsi kasutamisel. Lisaks on kuld bioühilduv, keemiliselt inertne, optilist tihedust saab reguleerida 530 nm-lt lähiinfrapunani ning proovi ettevalmistamine on lihtne ja ökonoomne29.
Ristvõre lainefrondi mikroskoopia (CGM) võimaldab mitte ainult temperatuuri kaardistada mikroskaalal, vaid ka jälgida biomassi, muutes selle eriti kasulikuks (kui see pole vajalik) koos LA-HTM-iga. Viimase kümnendi jooksul on välja töötatud muid temperatuurimikroskoopia tehnikaid, eriti biopildistamise valdkonnas, ja enamik neist nõuab temperatuuritundlike fluorestsentssondide kasutamist54,55. Neid meetodeid on aga kritiseeritud ja mõned aruanded on mõõtnud ebareaalseid temperatuurimuutusi rakkudes, mis võib olla tingitud asjaolust, et fluorestsents sõltub paljudest muudest teguritest peale temperatuuri. Lisaks on enamik fluorestseeruvaid sonde kõrgetel temperatuuridel ebastabiilsed. Seetõttu on QPM ja eriti CGM ideaalne temperatuurimikroskoopia tehnika elu uurimiseks kõrgel temperatuuril optilise mikroskoopia abil.
Optimaalselt 80 °C juures elava S. shibatae uuringud näitavad, et LA-HTM-i saab rakendada hüpertermofiilide, mitte ainult lihtsate termofiilide uurimiseks. Põhimõtteliselt ei ole LA-HTM-i abil saavutatavatel temperatuuridel piiranguid ja isegi temperatuure üle 100 °C on võimalik saavutada atmosfäärirõhul ilma keetmiseta, nagu on näidanud meie 38-liikmeline rühm hüdrotermilise keemia rakendustes atmosfääris. rõhk A. Kulla nanoosakeste 40 kuumutamiseks kasutatakse samamoodi laserit. Seega on LA-HTM-i potentsiaal kasutada enneolematute hüpertermofiilide vaatlemiseks standardse kõrglahutusega optilise mikroskoopiaga standardtingimustes (st keskkonnastressi korral).
Kõik katsed viidi läbi omatehtud mikroskoobiga, sealhulgas Köhleri valgustusega (LED-ga, M625L3, Thorlabs, 700 mW), käsitsi xy liikumisega proovihoidjaga, objektiividega (Olympus, 60x, 0,7 NA, õhk, LUCPlanFLN60X või 60x, NA, 1,25). , UPLFLN60XOI), CGM-kaamera (QLSI ristvõre, 39 µm samm, 0,87 mm Andor Zyla kaamerasensorist) intensiivsuse ja lainefrondi pildistamiseks ning sCMOS-kaamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitine režiim, Hamamatsu) salvestamiseks joonisel 5 näidatud andmed (bakteriaalne ujumine). Dikroonse kiire jaotur on 749 nm BrightLine'i serv (Semrock, FF749-SDi01). Kaamera esiküljel olev filter on 694 lühipääsfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titaansafiirlaser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumbatav tsunami laseri õõnsus, Spectra-Physics joonisel 2-5, lisaks asendatud Millenia laseriga, Spectraphysics 10 W, pumbatav Mira laseri õõnsus, koherent, joonisel 2 -5). 6 ja 7) on seatud lainepikkusele \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, mis vastab kulla nanoosakeste plasmonresonantsi spektrile. Ruumilised valgusmodulaatorid (1920 × 1152 pikslit) osteti firmalt Meadowlark Optics. Hologrammid arvutati Gerchberg-Saxtoni algoritmi abil, nagu on kirjeldatud lingis 39.
Ristvõre lainefrondi mikroskoopia (CGM) on optilise mikroskoopia tehnika, mis põhineb kahemõõtmelise difraktsioonvõre (tuntud ka kui ristvõre) kombineerimisel ühe millimeetri kaugusel tavalisest kaamera andurist. Kõige tavalisem näide CGM-ist, mida oleme selles uuringus kasutanud, nimetatakse nelja lainepikkuse põiksuunalise nihke interferomeetriks (QLSI), kus ristvõre koosneb intensiivsuse / faasi malelaua mustrist, mille on kasutusele võtnud ja patenteerinud Primot jt. aastal 200034. Vertikaalsed ja horisontaalsed võrejooned tekitavad andurile ruudustikutaolisi varje, mille moonutusi saab reaalajas arvuliselt töödelda, et saada langeva valguse optiline lainefrondi moonutus (või samaväärne faasiprofiil). Mikroskoobis kasutamisel saab CGM-kaamera kuvada pildistatud objekti optilise tee erinevust, mida tuntakse ka kui optilist sügavust (OT), tundlikkusega nanomeetrites36. Mis tahes CGM-mõõtmise korral tuleb optiliste komponentide või kiirte defektide kõrvaldamiseks teha esmane OT-kujutis, mis lahutatakse järgmistest kujutistest.
Temperatuurimikroskoopia viidi läbi CGM-kaamera abil, nagu on kirjeldatud viites. 32. Lühidalt öeldes muudab vedeliku kuumutamine selle murdumisnäitajat, tekitades termilise läätse efekti, mis moonutab langevat kiirt. Seda lainefrondi moonutust mõõdetakse CGM-iga ja töödeldakse vedelas keskkonnas kolmemõõtmelise temperatuurijaotuse saamiseks dekonvolutsioonialgoritmi abil. Kui kulla nanoosakesed on kogu proovis ühtlaselt jaotunud, saab paremate kujutiste saamiseks teha temperatuuri kaardistamist bakterivabades piirkondades, mida me mõnikord teeme. Võrdlus CGM-kujutis saadi ilma kuumutamiseta (väljalülitatud laseriga) ja seejärel jäädvustati kujutise samas kohas laseriga.
Kuivmassi mõõtmiseks kasutatakse sama CGM-kaamerat, mida kasutatakse temperatuuri pildistamiseks. CGM-i võrdluspildid saadi proovi kiirel liigutamisel x ja y särituse ajal, et keskmistada bakterite olemasolust tingitud OT ebahomogeensus. Bakterite OT-piltidest saadi nende biomass, kasutades Matlabi omatehtud segmenteerimisalgoritmi abil valitud alade kujutiste kogumit (vt alajaotist „Arvkood”), järgides viites kirjeldatud protseduuri. 48. Lühidalt, me kasutame seost \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kus \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) on optilise sügavuse kujutis, \(m\) on kuivkaal ja \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) on konstant. Valisime \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, mis on tüüpiline elusrakkude konstant.
Kulla nanoosakestega kaetud 25 mm läbimõõduga ja 150 µm paksune katteklaas asetati AttofluorTM kambrisse (Thermofisher) kulla nanoosakesed ülespoole. Geobacillus stearothermophilust eelkultuuriti üleöö LB söötmes (200 p/min, 60 °C) enne iga katsepäeva. Kulla nanoosakestega katteklaasile asetati tilk 5 µl G. stearothermophilus'e suspensiooni optilise tihedusega (OD) 0,3 kuni 0,5. Seejärel tilgati tilgale ümmargune 18 mm läbimõõduga katteklaas, mille keskel oli 5 mm läbimõõt, ja augu keskele kanti korduvalt 5 μl sama optilise tihedusega bakterisuspensiooni. Katteklaaside süvendid valmistati ette viites kirjeldatud protseduuri kohaselt. 45 (lisateabe saamiseks vaadake lisateavet). Seejärel lisage katteklaasile 1 ml LB söödet, et vältida vedela kihi kuivamist. Viimane katteklaas asetatakse Attofluor™ kambri suletud kaane peale, et vältida söötme aurustumist inkubeerimise ajal. Idanemiskatseteks kasutasime eoseid, mis pärast tavalisi katseid katsid mõnikord ülemise katteklaasi. Sarnast meetodit kasutati ka Sulfolobus shibatae saamiseks. Kolm päeva (200 pööret minutis, 75 °C) kultiveeriti Thiobacillus serrata eelkultiveerimist söötmes 182 (DSMZ).
Kulla nanoosakeste proovid valmistati mitsellplokk-kopolümeeri litograafia abil. Seda protsessi kirjeldatakse üksikasjalikult peatükis. 60. Lühidalt, kullaioone kapseldavad mitsellid sünteesiti, segades kopolümeeri HAuCl4-ga tolueenis. Seejärel kasteti puhastatud katteklaasid lahusesse ja töödeldi kullaseemnete saamiseks UV-kiirgusega redutseeriva aine juuresolekul. Lõpuks kasvatati kullaseemneid, viies katteklaasi kokku KAuCl4 ja etanoolamiini vesilahusega 16 minuti jooksul, mille tulemuseks oli mittesfääriliste kulla nanoosakeste kvaasiperioodiline ja väga ühtlane paigutus lähi-infrapunas.
Interferogrammide teisendamiseks OT-piltideks kasutasime omatehtud algoritmi, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud lingis. 33 ja on saadaval Matlabi paketina järgmises avalikus hoidlas: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakett suudab arvutada intensiivsust ja OT-pilte salvestatud interferogrammide (kaasa arvatud võrdluspildid) ja kaamera massiivi kauguste põhjal.
SLM-ile rakendatud faasimustri arvutamiseks antud temperatuuriprofiili saamiseks kasutasime eelnevalt välja töötatud omatehtud algoritmi 39, 42, mis on saadaval järgmises avalikus hoidlas: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Sisendiks on soovitud temperatuuriväli, mida saab seadistada digitaalselt või monokroomse bmp-pildi kaudu.
Lahtrite segmenteerimiseks ja nende kuivkaalu mõõtmiseks kasutasime järgmises avalikus hoidlas avaldatud Matlabi algoritmi: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Igal pildil peab kasutaja klõpsama huvipakkuval bakteril või mCFU-l, reguleerima võlukepi tundlikkust ja kinnitama valiku.
Lisateavet uuringu kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.
Selle uuringu tulemusi toetavad andmed on mõistliku taotluse korral kättesaadavad vastavatelt autoritelt.
Selles uuringus kasutatud lähtekoodi on üksikasjalikult kirjeldatud jaotises Meetodid ja silumisversioonid saab alla laadida aadressilt https://github.com/baffou/ järgmistes hoidlates: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ja CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Ülevaade termofiilidest ja nende laiaulatuslikest rakendustest. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Ülevaade termofiilidest ja nende laiaulatuslikest rakendustest.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ja Sharma, AK Ülevaade termofiilidest ja nende laialdasest kasutamisest. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ja Sharma AK Sügav arusaam termofiilidest ja paljudest rakendustest.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Postitusaeg: 26. september 2022